青海省2011-2012年乙型流感病毒HA1基因特性研究

于 娟，饶华祥，李 红，卢囡囡，易 虎，赵生仓

自1983年以来，乙型流感病毒按其抗原特性和基因特征分为两大谱系：Yamagata系和Victoria系[1-2]。同甲型流感毒一样，乙型流感病毒也是依靠病毒外膜蛋白，特别是血凝素的重链HA1基因的变异，改变抗原特性来逃避抗体已有免疫保护，从而不断导致流感的流行[3]。

青海省自2009年甲型H1N1流感疫情爆发后，乙型流感一直处于低流行水平，直到2011年出现上升趋势。本研究首次对青海省乙型流感分离株HA1基因变异情况进行系统研究，以便在分子水平上了解其变异特点和规律，及时发现变异株，为流感流行起到预警作用。通过与WHO北半球推荐疫苗株进行比较，了解目前疫苗株对青海省人群的保护效果，为流感的预防和控制提供参考。

1 材料与方法

1.1标本和毒株来源 采集2011年1月至2012年12月青海省流感监测哨点医院的流感样病例的鼻咽拭子5302份，采用MDCK细胞对流感病毒进行分离培养，血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)对流感病毒进行鉴定，具体步骤见参考文献[3]。

1.2病毒RNA提取 采用德国Qiagen Rneasy Mini Kit(74104)，按照试剂盒中操作手册所提供的方法提取病毒RNA。

1.3RT-PCR 使用德国Qiagen One-step RT-PCR kit (210212)，美国Promega RNase Inhibitor(277470)，HA1基因RT-PCR上游引物：5’- GAAGGCAATAATTGTACT-3’，下游引物：5’- ACCAGCAATAGCTCCGAA -3’[4](均为大连宝生物公司合成)，加入提取的5 μL RNA模板，参照试剂盒中说明书配制成25 μL体系，按以下条件进行PCR扩增：60 ℃1 min，42 ℃10 min，50 ℃30 min，95 ℃15 min，(94 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃1 min)35 cycles，72 ℃10 min。

1.4PCR产物纯化及核苷酸序列测定 使用德国Qiagen MinElute PCR Purification Kit (28006)对RT-PCR产物进行纯化，纯化后产物采用美国 AB公司BigDye Terminator v1.1 kit (4337450)，参照试剂盒说明书配制成20 μL体系，按以下条件进行测序PCR扩增：96 ℃1 min，(96 ℃10 s，50 ℃5 s，60 ℃4 min)25 cycles。测序产物采用Qiagen DyeEx 2.0 Spin Kit (63204)进行纯化后在ABI3500基因分析仪上进行测序，具体操作方法参照仪器操作说明。

1.5序列分析 采用DNA Star 5.0 MegAlign和MEGA 4.0软件将分离株与近10年WHO推荐的疫苗株、Yamagata 系和Victoria 系代表株以及同期其他地区分离株进行HA1基因特征分析。核苷酸序列采用MEGA 4.0自带的Clustal W软件进行比对，NJ法(邻接法)构建基因进化树，Bootstrap检验重复值设定为1000，以上序列均来自GenBank。

2 结 果

2.1流感毒株流行情况 2011年青海省共分离流感毒株35株，其中Victoria系乙型毒株17株，占48.57%，Yamagata系乙型毒株15株，占42.86%， H3亚型2株，占5.71%，新甲H1亚型毒株1株，占2.86%。2012年青海省共分离流感毒株85株，其中Victoria系乙型毒株34株，占40.00%，Yamagata系乙型毒株3株，占3.53%，H3亚型36株，占42.35%，新甲H1亚型毒株12株，占14.12%。总体来说，青海省2011年上半年Yamagata系作为优势流行株在人群中广泛流行，下半年活动逐渐减弱，12月份Victoria系毒株活动逐渐加强，在2012年4月份之前为优势流行株，之后H3亚型代替Victoria系毒株成为优势流行株。

2.2血凝素HA1基因进化树分析 从基因进化树可以看出，2011-2012年青海省乙型流感毒株主要分为Victoria系和Yamagata系两个进化分支，且相同或相近年份分离株聚集成簇。2011年青海省Victoria系乙型分离株B/Qinghaichengdong/1223/2011和B/Qinghaichengzhong/2115/2011与同期广东分离株亲缘关系较近，B/Qinghaichengdong/1410/2011与2010年广东、北京、宁波分离株亲缘关系较近，以上毒株与2009-2011年WHO推荐疫苗株B/Brisbane/60/2008亲缘关系较远，未处于同一进化分支；2011年底和2012年的Victoria系乙型分离株与2009-2011年WHO推荐疫苗株B/Brisbane/60/2008及2012年湖州分离株亲缘关系较近，处于同一分支。可以看出，所有分离株已逐渐远离Victoria系代表株B/Victoria/2/87及以往WHO推荐疫苗株：B/Hongkong/330/2001(2002-2004)和B/Malaysia/2506/2004(2006-2008)。2011年青海省Yamagata系乙型分离株与2011-2012年WHO推荐疫苗株B/Wisconsin/01/2010及同期广东分离株处于同一分支，亲缘关系较近，但已逐渐远离以往Yamagata系代表株B/Yamagata/16/88及以往WHO推荐疫苗株：B/Shanghai/361/2002(2004-2006和B/Florida/4/2006(2006-2008)(见图1)。

2.3Victoria系分离株HA1基因分析

2.3.1核苷酸同源性分析 本研究测得Victoria系分离株HA1基因984 bp，青海本地分离株间同源性为85.8%～98.9%，本地分离株与2009-2011年WHO推荐疫苗株B/Brisbane/60/2008同源性为88.6%～95.7%。

2.3.2核苷酸推导的氨基酸位点差异比较 与2009-2011年WHO推荐疫苗株B/Brisbane/60/2008相比，2011年青海省Victoria系分离株的氨基酸变异位点有L58P，I146V，N171D，L303I，Y309D，A317S，P322S，其中I146V，N171D位于抗原决定簇；2012年分离株的氨基酸变异位点有N123D，I146V，Q264H，P322S，其中N123D，I146V位于抗原决定簇(见表1)。可以看出，I146V变异发生在所有青海分离株中，其余氨基酸位点变异不具有普遍性，呈散在性分布。糖基化位点分析后，发现P322S使得分离株在320位增加了一个糖基化位点。

图1 乙型流感病毒血凝素HA1 基因进化树

2.3Yamagata系分离株HA1基因分析

2.3.1核苷酸同源性分析 本研究测得Yamagata系分离株HA1基因990 bp，本地分离株间同源性为97.6%～99.8%，本地分离株与2011-2012年WHO推荐疫苗株B/Wisconsin/01/2010同源性为97.7%～99.3%。

2.3.2核苷酸推导的氨基酸位点差异比较 与2011-2012年WHO推荐疫苗株B/Wisconsin/01/2010相比，2011年青海省Victoria系分离株的氨基酸变异位点有N116K，D196N，D232N，L267V，其中N116K，D196N位于抗原决定簇，发生在所有青海分离株中，其余位点变异不具有普遍性，呈散在性分布。经过糖基化位点分析，发现B/Qinghaidatong/220/2011与疫苗株相比发生了D232N变异，使其在232位增加了一个糖基化位点；所有青海分离株均发生了D196N变异，使分离株在196位增加了一个糖基化位点，位于抗原决定簇。

表1 Victoria系乙型流感毒株HA1基因重要氨基酸变异位点比较

3 讨 论

目前发现乙型流感病毒仅发生抗原性漂移，而不发生像甲型流感病毒那样的抗原性转变，因此，乙型流感常常在人群中仅引起一些局部和中等程度的流行。尽管流感病毒的抗原性经常不断地发生变异，但并非所有的变异株都具有流行病学意义。

表2 Yamagata系乙型流感毒株HA1基因重要氨基酸变异位点比较

乙型流感病毒HA1基因的第70～ 90位和110～ 210位氨基酸参与病毒抗原决定簇的构成，此其间氨基酸变异会导致病毒抗原性改变[4]。作为一个具有代表性的新变种，它必须在HA1区蛋白分子上有4个以上氨基酸序列发生了替换，而且替换必须涉及到2～3个抗原决定簇位点[5]。对2011-2012年青海省分离到的乙型流感毒株HA1区核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析后发现，Victoria系分离株与2009-2011年WHO推荐疫苗株B/Brisbane/60/2008同源性为88.6%～95.7%，氨基酸替换数在2～5个，有1-2个参与构成抗原决定簇。Yamagata系与2011-2012年WHO推荐疫苗株B/Wisconsin/01/2010HA1区相比较同源性为97.7%～99.3%，氨基酸替换数在2-3个，有2个参与构成抗原决定簇。可以看出，Victoria系与Yamagata系分离株均已发生了一定变异，但尚没有发生病毒抗原漂移。值得注意的是Yamagata系分离株均在196位增加了一个糖基化位点，糖基化位点的增加或减少对病毒抗原性及其他生物特性均有一定的影响，尤其发生在抗原决定簇附近的糖基化会影响抗体的结合，我们应密切关注其对分离株的影响。

研究发现，流感疫苗对人体的免疫保护效果取决于流行株与疫苗株之间的抗原匹配程度，匹配程度越高，免疫保护效果越好。由于2009-2011年WHO推荐疫苗株B/Brisbane/60/2008对2011为Victoria系代表株，青海地区人群中对Victoria系流感病毒已形成了一定的免疫屏障，使得2011年初Victoria株的流行减弱，而人群中的Yamagata系病毒株抗体水平较低，使得Yamagata系毒株活动逐渐加强，成为优势流行株，提示B/Brisbane/60/2008对2011年青海地区人群没有起到很好的保护作用。2011-2012年WHO推荐流感疫苗B/Wisconsin/01/2010为Yamagata系代表株，且与2011年青海Yamagata系分离株亲缘关系较近，能够对人群产生较好保护作用，使得2011年Yamagata系株在下半年流行逐渐减弱，但造成Victoria系株在2011年12月份至2012年4月份活动逐渐增强，成为优势流行株，这与其他地区报道的2011-2012年乙型流感病毒流行趋势基本一致[6]。

在免疫系统选择压力下，乙型流感病毒必将不断发生变异以逃避宿主体内已有抗体的免疫保护，其在下一个流行季节会发生怎样的基因变异，还有待进一步的流感监测工作及基因特性分析，需加强流感病原学监测，及时发现新的乙型流感病毒变异株。

参考文献：

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[4]WHO.WHO information for molecular diagnosis of influenza virus in humans- update[EB/OL].http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/molecular_diagnosis/en/, 2013-04-15/2013-07-01.

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