结核分枝杆菌rHpsX-MPT64融合蛋白的制备与临床应用

张 艳，范大鹏，岳永宁，杜 蓬， 孙爱华

结核病已成为当前严重危害人类健康的公共卫生问题[1]。简便、快速而准确的实验室诊断对病人及时、有效的治疗至关重要[2]。细菌学检查目前仍是结核病诊断的金标准，但涂片阳性率低、培养所需时间太长，不能满足临床快速诊治需要，因此迫切需要开展快速、高灵敏度的的检测技术[2]。检测结核病患者血清抗体的血清学方法具有快速、简便已成为结核病最重要的诊断方法，国内外已有较多报道[2-3]。我们通过连接引物PCR构建融合基因hpsX-mpt64并克隆和原核表达，然而以重组蛋白rHspx、rMPT64和rHspx-MPT64为包被抗原的酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测277例肺结核患者的血清标本，探讨其在肺结核病实验诊断中的应用价值。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒、菌株及主要试剂 H37Rv、原核表达载体pET42a、宿主菌E.coliDH5α及E.coliBL21DE3均来自浙江大学病原生物系；DNA提取试剂盒购自BioColor公司，PCR试剂、PCR产物回收试剂盒、DNA胶回收试剂盒、T-A克隆试剂盒、质粒提取试剂盒、限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、IPTG、DNA及蛋白分子量参考标准品、Ni-NTA亲和层析材料等均由TaKaRa公司提供。HRP-羊抗人IgG和HRP-羊抗鼠IgG购自Immuno Research公司。抗His抗体购自Novagen公司。

1.1.2血清来源 277例结核病患者血清来自于根据临床表现、痰涂片和培养及X-线辅助诊断为肺结核的浙江省中西医结合医院(浙江省结核病诊断治疗中心)住院结核病患者，其中痰涂片阳性192例、阴性85例，73例非肺结核患者血清来自本院呼吸科住院肺炎、肺气肿等肺部疾病患者，150例健康对照血清标本来自于无结核病史、痰培养阴性且X-线辅助诊断无异常本院健康体检者。

1.2方法

1.2.1hpsX和mpt64基因的扩增 采用基因组DNA快速制备试剂盒(BioColor)提取标准菌株H37Rv的DNA。根据GenBank中登录H37Rv标准菌株hspX和mpt64基因序列[4](NC_000962)及其内切酶图谱分析结果，设计用于hspX和mpt64基因扩增的引物。hspX基因引物序列：上游 5’-CGCGGA TCC(BamH I) ATG GCC ACC ACC CTT CCC-3’，下游 5’-CGCAAG CTT(Hind III) TCA GTT GGT GGA CCG GAT CTG-3’； mpt64基因引物序列：上游 5’-CGCCAT ATG(Nde I) CGC ATC AAG ATC TTC ATG-3’，下游 5’-CGCGGA TCC(BamH I) GGC CAG CAT CGA GTC GAT-3’。PCR总体积100 μL，内含2.5 mol/L各dNTP、250 nmol/L各引物、15 mol/L MgCl2、2.5U EX-Taq酶(TaKaRa)、200 ng DNA模板、1×PCR缓冲液(pH8.3)。PCR参数：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s共30个循环，72 ℃ 7 min。采用溴乙锭预染的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。hspX和mpt64基因目的扩增片段预期大小分别为435 bp和687 bp。

1.2.2hpsX-mpt64融合基因的构建 hpsX上游和mpt64下游引物序列同上。hpsX下游和mpt64上游连接柔性肽GGGSGGGS引物序列为。hpsX下游连接引物序列：5’-GCT GCC ACC GCC GCT GCC ACC GCC(柔性肽GGGSGGGS序列) GTT GGT GGA CCG GAT CTG -3’。mpt64上游连接引物序列：5’-GGC GGT GGC AGC GGC GGT GGC AGC(柔性肽GGGSGGGS序列) Atg CGC ATC AAG ATC TTC ATG -3’。按上法将hpsX和mpt64基因扩增后，用小量DNA 3S柱快速离心纯化试剂盒(BioColor)回收目的片段，分光光度法测定其DNA浓度[5]。将上述回收的hpsX和mpt64基因目的扩增片段后等摩尔混合(DNA总量<500 ng)，反应参数：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、45 ℃ 30 s、72 ℃ 180 s共10个循环，72 ℃ 15 min，除不加引物外，其余反应成分及含量与上述PCR相同，如此可利用hpsX下游和mpt64上游连接引物中互补的柔性肽序列形成hpsX-mpt64复合模板。然后加入hpsX上游和mpt64下游引物各250 nmol/L，PCR参数：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 120 s共30个循环，72 ℃ 10 min，hpsX-mpt64融合基因扩增片段预期大小为1 146 bp。

1.2.3目的基因T-A克隆、亚克隆和测序 采用T-A克隆试剂盒(TaKaRa)，分别将上述hpsX、mpt64基因及hpsX-mpt64融合基因扩增片段克隆至pMD18-T载体中，转化入E.coliDH5α并用LB培养基扩增，小量碱变性法提取重组质粒[4]，委托Invitrogen公司测序。采用对应内切酶分别酶切重组质粒pMD18-T- hpsX、pMD18-T- mpt64、pMD18-T- hpsX-mpt64和表达质粒pET42a，各目的片段回收后分别连接。将构建原核重组表达载体pET42a-hpsX、pET42a- mpt64和pET42a-hpsX-mpt64分别转化于表达宿主菌E.coliBL21DE3中，经培养扩增、提取质粒后再次测序。

1.2.4目的重组蛋白表达和免疫反应性鉴定 构建的原核重组表达系统pET42a-hpsX-E.coli BL21DE3、pET42a-mpt64-E.coli BL21DE3、pET42a-hpsX-mpt64-E.coli BL21DE3，IPTG诱导目的蛋白表达，SDS-PAGE检查目的重组蛋白rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64表达情况，用BioRad凝胶图象分析系统检测其表达产量，Ni-NTA亲和层析法提纯目的表达产物，纯化的重组蛋白rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64进行SDS-PAGE，再将电泳凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上，用5%的脱脂奶封闭2 h，加抗组氨酸的特异性单抗4 ℃孵育过夜，以0.2 mmol/L PBST洗涤后，加羊抗鼠IgG室温作用1 h，以DAB显色观察结果。

1.2.5检测结果的分析和比较 采用Stata 8.0统计学软件中的χ2检验，对不同检测方法的检测结果进行比较，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1PCR及测序结果 采用溴乙锭预染的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。在435 bp、687 bp和1 146 bp 位置分别有hspX、mpt64和hpsX-mpt64对应目的扩增片段，见图1。与报道的相应序列比较，所克隆的hpsX和mpt64基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%。hpsX-mpt64融合基因核苷酸和氨基酸序列与hpsX和mpt64基因完全相同，各基因或融合基因的T-A克隆和亚克隆测序结果也完全相同。上述序列比较时不包括引物序列。

图1hspX、mpt64和hpsX-mpt64基因PCR结果

Fig.1AmplificationfragmentsofhspX,mpt64andhpsX-mpt64genes

M: DNA marker (TaKaRa); 1, 3, 5: Bank control; 2, 4, 6: PCR products of hspX, mpt64 and hpsX-mpt64 genes.

2.2重组蛋白表达、提纯效果及鉴定结果 IPTG能有效地诱导rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64的表达，其产量分别约占细菌总蛋白的20.3%、28.5%和26.5%，主要以可溶性蛋白的形式存在，提纯的rHpsX-MPT64经SDS-PAGE后均显示为单一的蛋白条带(图2)。将纯化后的重组蛋白rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64与抗组氨酸的特异性单克隆抗体做免疫印迹分析后显示，分别在16.0 kDa、24.0 kDa和42.0 kDa处形成一特异条带(此处不显示)，表明纯化的重组表达产物rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64有免疫反应性。

2.3ELISA检测结果 rHpsX-ELISA、rMPT64-ELISA和rHpsX-MPT64为包被抗原的ELISA分别检测上述150例健康人血清标本的OD450均值和SD值，OD450均值和SD值分别为0.26和0.08、0.25和0.07、0.28和0.09，故阳性判断参考值分别为0.42、0.39和0.46。根据上述阳性判断标准，ELISA检测277例结核患者(包括痰涂片阳性192例、阴性85例)、73例非结核肺部疾病患者和150例健康对照人血清，结果见表1，2。rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64抗原对涂阳患者血清抗体检出率分别为69.8%、71.9%和82.8%明显高于涂阴患者检出率(分别为35.3%、37.6%和55.3%)(P<0.01)。rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64抗原检测肺结核患者血清抗体的敏感性分别为59.2%、61.4%和74.4%，rHpsX-MPT64为包被抗原建立的ELISA方法敏感性明显高于rHpsX和rMPT64抗原(χ2=14.4和10.7，P<0.01)。

图2rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64蛋白表达和提纯效果

Fig.2ExpressionandpurificationeffectsofrHpsX,rMPT64andrHpsX-MPT64protein

M: Protein marker (Generay Biotech); 1: The pET42a-BL21 without IPTG induction; 2-4: Recombinant proteins rHpsX, rMPT64 and rHpsX-MPT64 with IPTG induction, respectively; 5-7: Purified proteins rHpsX, rMPT64 and rHpsX-MPT64, respectively.

2.4不同的ELISA方法特异性比较 rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64为包被抗原建立的ELISA检测对照组(包括73例非肺结核患者和150例健康对照组)血清抗体，结果见表2。各ELISA检测非肺结核患者和健康对照组方法特异性无显著性差异(χ2=0.1～0.6，P>0.05)。rHpsX-MPT64抗原检测对照组血清抗体特异性高于rMPT64抗原(χ2=5.2，P<0.01)，但与rHpsX抗原比无显著性差异(χ2=0.03，P>0.05)。

表1 不同的ELISA检测结核病患者血清结果

Note: ▲Bacterium-positive TB patients were stronger than that in the bacterium-negative (P<0.01); ◆The sensitivity of ELISA using rHpsX-MPT64 as the antigen was higher than that of ELISA using rHpsX and rMPT64 as the antigens (P<0.01).

表2 不同的ELISA方法特异性

Note: ▲P>0.05 versus healthy individuals; ◆The specificity of ELISA using rHpsX-MPT64 as the antigen was higher than that of ELISA using rMPT64 as the antigen.

3 讨 论

血清学方法能快速简便的检测结核病患者血清抗体，为临床诊断提供依据[2]。然而，目前已经研究的多数结核分枝杆菌抗原血清学试验敏感性普遍不高，特别是对涂片阴性患者检出率更低，这就要求人们不断努力发现新的结核抗原建立灵敏度较高的血清诊断学方法[2-3]。由于结核患者的免疫功能、遗传背景和治疗方式不同而导致对结核杆菌抗原识别的差异性，各种抗原都有其优缺点，目前没有任何一种单一抗原能被全部或大多数结核病患者血清所识别[2, 6]。因此来源方便且免疫原性强的抗原仍是用于建立检测结核病患者血清抗体方法努力的方向。HpsX蛋白主要存在于细菌的胞膜中，hpsX基因编码蛋白分子量约为16 kD。当结核菌感染机体后，HpsX蛋白能诱导特异性的抗体免疫应答。另外，由于HpsX蛋白基因仅存在于结核分枝杆菌复合群且与结核分枝杆菌致病性相关，同时16 kD蛋白具有伴侣活性，可作为很好的协同抗原。因此，HpsX蛋白可能是一较为理想的筛选活动性肺结核的免疫学抗原[6]。MPT64是结核分支杆菌复合体分泌的一种蛋白，分子量为24 kD，可引起T细胞反应刺激淋巴细胞分泌干扰素，在结核分支杆菌分泌蛋白中是具有较高研究价值的蛋白之一[6]。

印度学者Sumi等[7]研究人工合成重组蛋白PlcA、HspX、Tb8.4和ESAT-6作为包被抗原建立ELISA用于检测结核患者血清抗体，单个抗原包被的灵敏度范围49.3%～60.8%，将四种抗原混合后则灵敏度提高达到75.4%；阿根廷学者Imaz1等[8]研究人工合成重组蛋白38-kDa、Ag16和Ag85B作为包被抗原建立ELISA用于检测结核患者血清抗体，单个抗原包被的灵敏度范围25%～42%，而混合抗原后则灵敏度提高到55%。上述研究者还证明多个抗原混合不仅提高了方法的灵敏度且能保持高度特异[7-8]，但多个抗原制备需建立多个原核表达系统、通过多次包被完成费时、费力。而我们在研究梅毒血清学诊断方法时建立了融合重组蛋白rTpN15-17-47为包被抗原的ELISA，临床应用证明融合基因原核表达蛋白作为抗原进行血清学检测不仅能提高方法的灵敏度、保持高度特异性，且避免了多个抗原获得所需多次表达及提纯抗原[9]。为此，我们用引物连接法成功构建了hspX-mpt64融合基因，并建立了hspX-mpt64融合基因原核表达系统，可表达单一人工抗原分子rHpsX-MPT64，表达量达细菌总蛋白的26.5%，两者之间以柔性短肽连接，以保持融合分子有良好的空间构型。获得的重组抗原rHpsX、rMPT64和融合重组抗原rHpsX-MPT64建立的ELISA用于检测不同血清标本，rHpsX-MPT64对确诊为结核病患者血清检测的阳性率为74.4%明显高于rHpsX(59.2%)和rMPT64抗原(61.4%)(P<0.01)，尤其是对涂片阴性结核病患者血清rHpsX-MPT64抗原检测的阳性率也高达55.3%，明显高于Kulshrestha A[10]等利用重组蛋白ESAT-6、CFP10、14Kda和MTC28为抗原建立ELISA检测涂阴结核灵敏度为2%～9%、Greenaway C[11]等利用重组蛋白ESAT-6、MTB11、19-kDa和16-kDa为抗原建立ELISA检测涂阴结核灵敏度为26%～54%的报道。且融合重组蛋白rHpsX-MPT64所建立的ELISA检测健康对照人和非结核肺部疾病患者特异性均较高分别为90%和93.2%。本研究中建立的rHpsX-MPT64-ELISA是一种敏感性和特异性较高的结核患者血清学诊断方法。

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