弓形虫主要抗原及其疫苗的研究进展

张清国(综述),黄炳成(审校)

2.济宁医学院,济宁 272013

弓形虫主要抗原及其疫苗的研究进展

张清国1,2(综述),黄炳成1(审校)

2.济宁医学院,济宁 272013

弓形虫病(Toxoplasmosis)是由专性细胞内寄生的弓形虫病原体引起的一种人兽共患寄生虫病,广泛流行于我国和世界各地〔1〕。特别是近年来随着人们生活水平的提高,食物来源的多样化,饮食习惯的改变,饲养宠物人数的增多,弓形虫感染呈明显上升趋势,已引起国内外学者的高度关注,并对弓形虫主要抗原及其免疫特性进行了大量的探索研究,认为研制安全、有效的疫苗成为预防与治疗弓形虫病的发展方向。弓形虫抗原的研究工作经历了全虫抗原、虫体特异组分抗原和重组抗原阶段,其疫苗研究也经历了灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗的发展阶段〔2-3〕。本文将对近年来弓形虫主要抗原及其疫苗的研究进展作一综述。

1 弓形虫膜表面抗原

1.1 主要表面抗原1(SAG1) SAG1是速殖子表面抗原,又称 P30。1988 年 Burg JL〔4〕等首先克隆并分析了P30基因的序列,基因全长1 634bp,是单一拷贝基因,不含有内含子。其编码区序列(CDS)从311～1 321bp,其中311～541bp编码疏水性的信号肽序列。Mineo JR〔5〕对 P30抗原在弓形虫入侵宿主细胞过程中的作用进行研究,发现鼠抗P30多克隆抗体能抑制速殖子对成纤维细胞的粘附接近75%,单克隆抗体可抑制65%;而P30突变株结合细胞的能力明显下降,说明P30在粘附宿主细胞膜的过程中起到配体的作用。鉴于此,研究者对P30作为候选疫苗的免疫保护性和诊断抗原的特异性进行了大量的研究,P30基因已分别在原核、真核和昆虫细胞中表达,表达蛋白有融合和非融合两种形式。研究表明P30是一个高度构象决定性抗原,表达产物的抗原活性与蛋白分子的正确折叠密切相关〔6-7〕。Qu D〔8〕等利用减毒的鼠伤寒沙门氏菌表达SAG1,构建了减毒活疫苗ZJ111/pSAG1-MIC3,口服免疫小鼠后可产生特异体液免疫和 Th1型细胞免疫(P＜0.05);RH强毒株弓形虫攻击实验结果显示,107和108CFU免疫组小鼠的成活率分别为20%和10%,而对照组小鼠全部死亡;免疫前和免疫后4w小鼠体重没有明显变化,并且免疫后6w脾脏和肝脏中的重组沙门氏菌被清除。Shang L〔9〕等用两种DNA疫苗 pVAX/TgSAG1和重组伪狂犬病毒rPRV/TgSAG1加强免疫效果,免疫组小鼠存活时间明显延长(15.4+/-5.0 d),存活率达40%,而对照组小鼠在 11d内全部死亡。Zhou XH〔10〕等将含有SAG1复合基因片段置于植物表达载体的E35S、E82.2启动子和E35S-E81.1嵌合启动子下,通过土壤杆菌转化土豆,Western blot检测显示,8株土豆能够成功表达预期的11 900分子量大小的蛋白质,其中2株能被SAG1单克隆抗体识别,为弓形虫的疫苗研制提供了新的方法和途径。

1.2 主要表面抗原2(SAG2) SAG2也是速殖子表面的一个抗原,又称P22。SAG2基因也是单拷贝基因,不含内含子,分子量22kDa。SAG2在弓形虫入侵宿主细胞及在其中的繁殖中起着重要的作用。用抗SAG2单克隆抗体中和SAG2后可将速殖子固定在宿主细胞膜表面阻止其入侵。因此,SAG2可能在速殖子入侵宿主细胞中起着重要的作用,可作为亚单位或重组疫苗的候选分子。王芳等〔11〕将SAG2基因亚克隆至酵母菌分泌表达载体pPICZα A中,再电转化转染至毕赤酵母菌GS115菌株,仅在重组酵母细胞内表达了分子质量为22 kDa的蛋白。以该重组酵母菌作为疫苗腹腔免疫BALB/c小鼠后产生了特异性抗SAG2抗体,表明具有一定的免疫原性。李俊华等〔12〕构建了含有穿梭表达质粒ps3000-SAG2或ps3000-GRA4的重组BCG疫苗,接种小鼠后发现弓形虫SAG2和GRA4重组BCG疫苗均能诱导小鼠产生免疫应答,分别于免疫后第 4、6、8wCD4+/CD8+、IgM 、IgG 抗体水平均有不同程度的提高。RH强毒株弓形虫速殖子攻击后,BCG-SAG2组平均存活8.61d,PBS对照组平均存活7.33d,3个免疫组小鼠比其他3组的平均存活时间长1d,表明弓形虫重组BCG疫苗具有一定的免疫保护性。

1.3 主要表面抗原3(SAG3) SAG3又称P43,是存在于弓形虫所有入侵阶段的一个膜蛋白。未成熟的SAG3由385个氨基酸残基组成,含有一个N端信号肽和GPI。SAG3是参与弓形虫入侵宿主细胞的一个主要分子,介导弓形虫对宿主细胞的识别和黏附。Lee YH 等〔13〕用重组GST-SAG3融合蛋白和GST-SAG3-QuilA(皂素的纯化物)免疫BALB/c小鼠,发现免疫组小鼠IgG2a抗体滴度、CD8+T淋巴细胞百分比,IFN-γmRNA表达水平和NO生成量均较对照组明显增加(P＜0.05);弓形虫攻击实验结果显示,免疫组小鼠的存活时间明显延长,脑包囊数量明显减少。说明重组SAG2能诱导T h1型免疫反应,对免疫小鼠具有部分保护性,Quil A具有免疫增强作用。

2 棒状体蛋白

2.1 棒状体蛋白1(ROP1) ROP1基因是一个单拷贝基因,全长约为2.1kb。ROP1蛋白约 60.5 kDa,其N端富含脯氨酸的酸性结构域,随后是碱性羧基末端区域〔14〕。弓形虫感染宿主细胞后,ROP1就出现在纳虫泡膜上,用抗ROP1的单抗处理后能抑制弓形虫对宿主细胞的黏附。杨秋林〔15〕等将含有ROP1的重组质粒L2pS-ROP1-T导入乳酸乳球菌,用重组乳酸乳球菌口服免疫小鼠发现,免疫组小鼠血清IgG水平和小肠液SIgA水平较对照组均有显著增高,提示该重组乳球菌能在小鼠小肠表达ROP1,且能诱导系统和黏膜局部的体液免疫应答,但攻击感染实验结果显示,免疫组小鼠无明显免疫保护性。

2.2 棒状体蛋白2(ROP2) ROP2是弓形虫棒状体分泌的另一个重要的蛋白,又称P54。ROP2基因全长2 234bp,不含内含子,未成熟的ROP2前体蛋白约66kDa,成熟的 ROP2约为54kDa,它也参与弓形虫侵入后纳虫泡膜的形成。在弓形虫入侵宿主细胞时由棒状体分泌到宿主胞质中,其羧基端定位于纳虫泡膜上,氨基端以可溶形式游离于宿主胞质中,与宿主的线粒体和内质网的联合有关。它在弓形虫生活史的速殖子期、缓殖子期以及子孢子期均有表达。最近研究发现ROP2家族的氨基端存在一系列的两亲性螺旋,单一的螺旋就可以粘附于细胞膜上,共同作用则优先粘附于新形成的纳虫泡膜〔16〕。Dziadek B〔17〕等用大肠杆菌E.coli表达的重组ROP2和ROP4免疫C3H/HeJ小鼠,发现两种重组抗原均能诱导产生系统性 Th1和Th2型免疫反应,以IgG1抗体为主。二者对弱毒DX株弓形虫的攻击实验均能提供部分保护性,免疫组脑组织中包囊数量减少46%。说明原核表达的重组 ROP2抗原能提供部分的免疫保护性,弓形虫不同时期的保护性抗原进行联合免疫的混合成分、多效价重组蛋白疫苗具有一定的应用前景。Wang H〔18〕等将ROP2基因全长序列克隆至分支杆菌表达载体pMV162的热休克蛋白hsp60启动子下,构建重组穿梭质粒pMV262-ROP2,电穿孔转化至BCG,获得重组BCG/pMV262-ROP2活疫苗,Western blot鉴定重组BCG能够表达ROP2蛋白。免疫BALB/c后发现重组BCG能诱导小鼠产生特异性的抗ROP2免疫反应,免疫组小鼠的死亡时间比对照组明显延长(P＜0.05)。表明重组BCG能有效表达和递呈弓形虫ROP2抗原,能诱导产生针对弓形虫感染的免疫反应 。魏庆宽〔19〕、张佃波〔20〕等已成功构建 pc-DNA3-ROP2、pET-ROP2-P30等重组质粒,分别用其重组体或表达蛋白免疫小鼠,均能能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应。免疫组小鼠血清抗体滴度高、CD4+T细胞增殖明显、CD4+/CD8+显著升高(P＜0.01);其脾淋巴细胞培养液及血清中多种细胞因子均有不同程度的升高。RH株弓形虫攻击感染后,实验组小鼠免疫保护率为88.9%,与对照组相比,小鼠存活时间明显延长、初始死亡时间明显延迟(P＜0.01)。可见ROP2蛋白、P30(SAG1)蛋白均为很有前途的疫苗候选抗原。

3 微线体蛋白

3.1 微线体蛋白2(MIC2) 研究发现弓形虫微线体蛋白2(TgMIC2)基因为单拷贝基因,含3个内含子,ORF全长2 307bp,编码含769个氨基酸残基,该蛋白Mr为115 000,在698～718位氨基酸残基之间有一个短的疏水信号肽,为典型的跨膜区。TgMIC2在虫体的各期都有表达,TgMIC2和TgM2AP以1∶1的比例形成复合体,该复合体为六聚体 ,包含 3 个 α β 二聚体。MH Huynh〔21〕等通过条件性基因表达调控系统将对无水四环素敏感的MIC2基因导入虫体,从而敲除内源的MIC2基因,MIC2基因表达的减少导致M2AP不能正确运输,虫体对宿主细胞的粘附和入侵能力明显减弱,螺旋状滑移运动消失,对小鼠不能造致死性感染,并且感染小鼠组织中的原虫负荷降低,炎性免疫反应减弱,获得较长时间的保护性免疫。该研究表明MIC2蛋白是弓形虫感染的主要毒力因素,而MIC2缺陷株是一种有效的活减毒疫苗。

3.2 微线体蛋白3(MIC3) 微线体蛋白3基因无内含子,ORF编码一个富含半胱氨酸的395个氨基酸残基的多肽,N端有一较短的疏水信号肽,无跨膜区域氨基酸序列中含5个表皮生长因子样结构域(EGF-like domain),其中3个串联排列,另2个与前3个有重叠,具有一个几丁质连接样结构域(chitin binding-like domain),这种序列能结合到宿主细胞上,跟宿主蛋白一样参与细胞与细胞、细胞与细胞外基质的相互识别作用。由于MIC3在弓形虫的速殖子、缓殖子和子孢子期都能表达,因此被认为是在弓形虫病的诊断和疫苗研制上非常有前景的候选分子。江涛等〔22〕发现MIC3基因在大肠杆菌中表达的融合蛋白经初步分离提纯后,1L培养液约含融合蛋白143mg,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的49%。Ismael AB〔23〕等发现编码表皮生长因子样结构域或几丁质连接样结构域的DNA疫苗均能提供一定的保护性。Fang R〔24〕等将 MIC3基因克隆至“自杀式”载体(suicidal vector)pSCA1,并比较了pSCA/MIC3和传统真核表达载体疫苗pcDNA/MIC3的免疫保护性,二者分别免疫BALB/c小鼠后发现两组小鼠的抗MIC3蛋白特异性抗体滴度、淋巴细胞体外增值反应的刺激指数和IFN-γ的表达水平均较对照组明显增高(P＜0.05),随后的攻击实验结果表明,两组小鼠的存活时间均较对照组显著延长,两免疫组间无差异。说明“自杀式”载体疫苗与传统核酸疫苗相比,也能提供较好的免疫保护性。由于其不能在宿主体内复制,较传统核酸疫苗具有更大的生物安全性,是一种很有潜力的疫苗。利用敲除MIC1和MIC3基因的RH株速殖子免疫OF1小鼠后,能够诱导强烈的体液免疫和Th1型细胞免疫反应,脑部组织包囊比对照组减少96%。并能阻断垂直传播,新生胎儿的感染率为4.6%而对照组高达 33.3%〔25〕。

4 致密颗粒蛋白

4.1 致密颗粒蛋白1(GRA1) 弓形虫侵入宿主细胞后纳虫泡形成,此后不久,弓形虫的另一类细胞器—致密颗粒开始释放内容物,即致密颗粒蛋白(如GRA1、GRA2、GRA4和GRA6 等),其中部分蛋白分布到纳虫泡膜的表面。GRA1又称为P24,其天然蛋白质分子量为23kDa,含有2个钙结合域,通过调节钙离子浓度来稳定纳虫泡膜。M Doskaya〔26〕等利用网络生物信息学技术对重组GRA1蛋白的结构进行预测,发现重组GRA1蛋白为折叠构象,适合对其结构、生物化学和疫苗的研究。谢荣华等〔27〕利用毕赤酵母菌 GS115真核表达 GRA1蛋白,用其经皮肤免疫小鼠发现,免疫组小鼠抗体水平高于混合蛋白组、福氏佐剂对照组和生理盐水对照组,且随免疫次数的增加抗体水平逐渐增高;CD8+细胞数则显著增殖,CD4+细胞数无明显增殖,CD4+/CD8+比值明显减少。免疫鼠受RH株速殖子攻击后存活时间明显延长,表明酵母菌表达的GRA1蛋白免疫小鼠具有一定的免疫保护作用。由于酵母表达系统易培养且表达量高,可进行疫苗大批量生产。

4.2 致密颗粒蛋白2(GRA2) GRA2又称P28,基因全长约1.3kb,含有一个长241bp的内含子,其初级翻译产物为一个由185个氨基酸组成的多肽,含有23个氨基酸长的信号肽,该产物富含丝氨酸和苏氨酸,推测GRA2可能是一个糖蛋白。GRA2依赖3个两性α螺旋(α 1:70～92,α 2:95～ 110和 α 3:119～139),在弓形虫侵入后起着诱导纳虫泡表面网络结构形成的作用。GRA2突变株虽然可以在成纤维细胞和巨噬细胞中正常的生长,但是弓形虫的毒力却大大下降,用GRA2突变株感染小鼠后,其存活率提高了许多,部分小鼠在急性感染后可以存活下来,说明GRA2可能是弓形虫毒力相关的一个基因。利用重组GRA2蛋白和佐剂单磷酰脂质A(MPL)免疫CBA/J小鼠后,能诱导产生高比例的IgG2a/IgG1特异性抗体,脾细胞体外经分泌-排泄抗原刺激后产生大量的IFN-γ和IL-2。经腹腔接种弓形虫包囊后,免疫组小鼠脑中包囊数明显少于对照组。说明重组GRA2能有效抵抗弓形虫慢性感染〔28〕。

4.3 致密颗粒蛋白3(GRA3) GRA3为单拷贝基因,GRA3的cDNA序列N端有2个起始密码子,其开放阅读框含有一个22氨基酸的疏水区和一个信号肽。GRA3蛋白分子量为30kDa,集中于内管网和纳虫泡膜(PVM),其功能可能为虫体获取营养 。为进一步明确 GRA3 的功能,MP Craver〔29〕等用氯霉素抗性基因取代II型弓形虫株的GRA3基因,获得GRA3基因缺失株△GRA3。研究发现野生株WT和缺失株△GRA3的在生长速度和缓殖子转化方面没有差异。而其感染小鼠的剂量为WT株半数致死量的4倍,而且所有△GRA3感染小鼠度过急性感染期。说明GRA3在弓形虫的急性感染期具有重要的作用。

4.4 致密颗粒蛋白4(GRA4) GRA4为单拷贝基因,无内含子,主要在速殖子中表达,翻译产物是一种分子质量单位为40ku的致密颗粒蛋白。GRA4基因全长1 536bp,内含一个1 038bp的开放阅读框架,能编码 346个氨基酸。GRA4富含脯氨基(12%),内含一个由19个氨基酸残基组成的疏水区域。李俊华等〔30〕将GRA4基因克隆入pGEM2T载体,然后亚克隆构建ps3000-GRA4大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒,再电转化至耻垢分枝杆菌。用重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠,Western blot分析显示免疫小鼠血清能够识别GRA4重组蛋白,表明重组耻垢分枝杆菌能在小鼠体内表达GRA4蛋白且具有抗原性,能刺激小鼠机体产生特异性抗弓形虫抗体。由于耻垢分枝杆菌是一种生长快,转化率高的突变株,并且本身也是一种非致病性和强的免疫佐剂,因此可以作为一种疫苗载体,该研究为弓形虫疫苗研究提供了新的途径。CHEN Rui等〔31〕利用脂质体包裹核酸疫苗pcDNA3.1-GRA4,通过肌肉注射免疫C57BL/6小鼠。末次免疫后14d,经口感染80个ME49株包囊,结果脂质体组小鼠的生存率达到72.7%,单独接种pGRA4组的生存率为54.5%,而空质粒对照组小鼠全部死亡。表明GRA4为良好的抗弓形虫感染疫苗候选抗原,而有效的基因递送系统可以诱导更有效的免疫反应。

4.5 致密颗粒蛋白7(GRA7) GRA7基因长约1.3kb,不含内含子,含有一个N端信号肽和一个潜在的糖基化位点,C端具有2个疏水区,其中靠近C末端的疏水区含有跨膜结构域。Joe Dan Dunn〔32〕等发现在虫体入侵宿主细胞的10min内,GRA7以串样结构出现在宿主细胞胞浆内,该串样结构还包括GRA1和GRA3,GRA7的磷酸化仅出现在宿主细胞内,与ROP2和ROP4结合。

5 展 望

弓形虫疫苗从最早采用的死虫疫苗到核酸疫苗,取得了令人鼓舞的成就,但是离实际应用于人体还有一段距离。虽然弓形虫是单细胞生物,但其生活史复杂,形态多样,宿主广泛,各抗原的免疫特性和致病分子机制亦不相同,复合型疫苗具有解决这些问题的潜力。核酸疫苗在其实用性、安全性及有效性方面显示出较好的优势,能同时诱导机体产生高水平的保护性体液免疫和细胞免疫。因此,弓形虫复合型疫苗和核酸疫苗仍是今后的研究方向。

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R382.5

A

1002-2694(2010)07-0683-05

黄炳成,Email:hbc863@hotmail.com

1.山东省寄生虫病防治研究所,济宁 272033;

2010-01-08;

2010-03-30