多重PCR检测食源金黄色葡萄球菌nuc、blaZ和mecA基因方法的建立与应用*

刘书亮,刘冬香,贾仁勇,韩新锋

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称Sa)是引起食物中毒的重要致病菌,也是造成人和动物感染的主要病原菌之一。食源耐甲氧西林Sa(Methicillin-resistant S.aureus,MRSA)的污染研究成为世界各国研究的热点。我国养殖业中广泛应用抗菌药,也引起广泛关注。

由于传统的细菌分离鉴定、毒素检测以及耐药性测定费时费力,敏感性差。PCR方法快速敏感,在Sa的种属基因鉴定及耐药性分析中已有不少报告〔1-3〕。由于基因的表达受多种因素调控,基因检测与表型存在一定差异〔4〕。本研究旨在建立快速鉴定食源Sa(耐热核酸酶基因,nuc)及检测Sa对β-内酰胺类药物耐药性(β-内酰胺酶基因,blaZ;甲氧西林耐药基因,mecA)的多重PCR方法,分析食源MRSA污染情况,同时比较表型与基因型的一致性和差异性。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 标准菌株:金黄色葡萄球菌ATCC33591为M RSA 阳性菌、ATCC29213为β-内酰胺酶阳性Sa,由中国农业大学动物医学院吴聪明博士惠赠;试验菌株:分离鉴定于成都等地市的猪源、牛源、鸡源动物性食品样品中的 79 株 Sa〔5〕,由四川农业大学食品微生物实验室保存。

1.1.2 培养基 Mueller-Hinton(M-H)肉汤:购自杭州微生物试剂有限公司;氨苄青霉素:由宝生物工程(大连)公司提供;LB培养基、氨苄青霉素平板(Amp-LB)自配。

1.1.3 抗生素 青霉素类:青霉素G(PEN)、氨苄西林(AMP)、苯唑西林(OXA)、阿莫西林-克拉维酸(AMC);头孢类:先锋唑啉(CFZ)、头孢曲松(CTX)、头孢噻呋(CEF);均为原药粉,由课题组统一提供。

1.1.4 分子生物学试剂 溶菌酶、2×Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker、GoldviewTMDNA染料均购自天根生化科技有限公司;DNA凝胶回收试剂盒、pMD18-T Simple Vector和感受态细胞E.coli JM109、dNT Pmixture、Taq聚合酶等购自宝生物工程(大连)有限公司;其它化学试剂均为分析纯。

1.1.5 主要仪器 MyCyclerPCR仪(Bio-RAD),PowerPac Basic电泳仪及水平电泳槽(Bio-RAD),凝胶成像系统(Bio-RAD),Milli-Q Gradient超纯水系统(Millipore公司),B4i-BR4i冷冻离心机(Thermo)等。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 按照美国临床实验标准委员会(NCCLS)(2007)进行药液配制,采用NCCLS推荐的肉汤微量稀释法对Sa进行β-内酰胺类抗生素(组合)药敏试验,并进行结果判定。

1.2.2 产β-内酰胺酶试验 按照赵旺胜等〔6〕的碘量法进行,以ATCC 29213为β-内酰胺酶阳性对照。

1.2.3 多重PCR方法建立

1.2.3.1 引物设计 根据GenBank中登录的Sa的nuc、blaZ、mecA 基因序列,利用Primer 5.0软件设计3对特异性引物(表 1),由 invitrogen公司合成。

表1 引物序列和产物大小Table 1 Primer Sequences and product sizes

1.2.3.2 模板制备 将分纯的Sa试验菌株和标准菌株分别接种于 LB肉汤,37℃震荡培养过夜。取2mL培养物于12 000r/min离心2min,收集菌体。根据唐俊妮〔7〕报道方法提取DNA。

1.2.3.3 单一基因PCR扩增 根据所设计的引物,在相同条件下以标准菌 ATCC33591和ATCC29213的 DNA为模板进行 nuc、blaZ和mecA的单一基因 PCR扩增。PCR反应体系(25μL)的组成 :2 ×Master Mix 12.5μL、Primer 1(10μ mol/L)1μL、Primer 2(10μ mol/L)1μL、Template 2μL、ddH2O 8.5μL。经预实验获得的 PCR反应程序为:94℃预变性5min,94℃变性45s,57℃退火50s,72℃延伸1.5min,进行30个循环,72℃延伸10min,PCR产物于4℃保存。

1.2.3.4 多重PCR条件优化 根据单一基因PCR建立多重PCR方法,反应体系仍25μL,其中2×Master Mix 12.5μL,Template 3μL,加入引物后,补 ddH2O至 25μL。逐一对引物浓度、退火温度、延伸时间和温度、循环次数进行优化。

1.2.3.5 琼脂糖凝胶电泳 PCR产物经1%(0.5×TBE)琼脂糖凝胶电泳后,观察并成像。

1.2.3.6 扩增产物测序鉴定:回收的扩增产物进行T克隆后由invitrogen公司测序,并进行序列分析。

1.2.4 多重PCR方法检测试验菌株 对食源79株Sa提取的DNA进行多重PCR检测,并与表型比较分析。

2 结果与分析

2.1 单一基因PCR结果 通过优化,退火温度为57℃时,各引物的单一基因PCR扩增均能获得较好结果(见图1),单一基因片段大小与预期结果相符。

图1 mecA、blaZ、nuc单一基因 PCR电泳结果Fig.1 PCR products of MecA,blaZ,nuc gene after gel electrophoresis

2.2 多重PCR条件优化 标准菌ATCC33591同时含有nuc、blaZ、mecA 3个基因,以该菌的基因组DNA为模板进行多重PCR条件优化。

2.2.1 引物优化结果 根据预实验结果,3对引物等比例混合后,在引物应用浓度均为0.4μ mol/L条件下的扩增结果表明,长片段产物相对较弱,因此,对引物组合nuc/blaZ/mecA设了8个应用浓度梯度,结果 0.2/0.2/0.4μ mol/L,0.2/0.2/0.6μ mol/L,0.4/0.4/0.8μ mol/L条件下均特异扩增出了3个目的片段,且条带较清晰,见图2,因此选择这3个浓度做进一步的PCR条件优化。

2.2.2 退火温度优化结果 根据引物优化结果,其它条件不变,比较在 54℃、55℃、56℃、57℃退火温度和3种引物浓度梯度下的扩增结果,最终确定引物组合nuc/blaZ/mecA的浓度是0.2/0.2/0.4μ mol/L,退火温度为56℃。退火温度优化结果见图3。

2.2.3 延伸时间和温度、循环次数的优化结果 根据对72℃延伸1min、1.5min、2min和68℃延伸2min比较显示,72℃延伸2min扩增效果最佳,同时反应循环次数优化结果表明,35次循环优越于30次循环反应(见图4)。因此,最佳的反应程序是:94℃预变性5min后,94℃变性50s,56℃退火50s,72℃延伸2min,进行35个循环,最后以72℃延伸10min。

2.3 基因测序结果与相似性分析 以ATCC33591的DNA为模板,扩增的nuc、blaZ、mecA单一基因产物序列分析表明,该菌株nuc、blaZ、mecA基因PCR产物测序分别得到长 229 bp、787 bp、1459 bp的片段,与设计大小完全符合;测得序列已在NCBI注册,登录号分别为 FJ809757、FJ809758、FJ810876,编码氨基酸序列登录号分别为ACO37595、ACO37596、ACO24928。采用 BLAST和DNA STAR MegAlign进行基因比对分析。

图4 延伸时间和温度以及循环数优化电泳结果Fig.4 PCR products with different extension times,temperatures and cycles after gel electrophoresis

ATCC33591的nuc基因(FJ809757)与登录号EF529596.1(SA strain G8)、CP000730.1(SA subsp.aureus USA300_TCH1516)和EF529608.1(SA strain 2513)等的nuc基因序列有98.7%～100%的相似性,其ACO37595与上述Sa菌株的耐热核酸酶的氨基酸序列的相似性高达98.7%～100%;而该基因与溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)(NC_007168)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)(NC_004461)相似性和编码相应氨基酸序列(YP_253498.1和NP_764559.1)相似性均较低。

ATCC33591的blaZ基因(FJ809758)与登录号AB245469.1(SA strain 80s-3)、AY917098.1(SA strain a53)、BX571856.1(SA strain MRSA252)、AJ302698.2(S.haemolyticus)、CP000028.1(S.epidermidis)、(S.intermedius,中间葡萄球菌)等的blaZ基因序列有98.5%～100%的相似性,其ACO37596与上述菌株的β-内酰胺酶的氨基酸序列的相似性达97.7%～100%。

ATCC33591的mecA基因(FJ810876)与登录号AB425824.1(SA strain JCSC6670)、AY271717.1(SA strain 2314)和CP000046.1(SA subsp.aureus COL)等mecA基因序列有99.7%以上的相似性,其ACO24928与上述菌株的PBP2a氨基酸序列的相似性也达99.2%以上。上述分析进一步表明该方法正确。

2.4 多重PCR方法对试验菌株检测结果 采用建立的Sa nuc、blaZ、mecA基因三重 PCR方法,对供试的 79株 Sa进行检测,结果只有 58株(占73.42%)同时扩增出nuc和blaZ基因,另有19株(占24.68%)只能扩增出nuc基因,所有菌株均未扩增出mecA基因,即无MRSA检出。该方法能鉴定出77株Sa,鉴定率为97.47%(77/79)。部分菌株的多重PCR检测结果,见图5。

图5 部分Sa菌株多重PCR检测结果Fig.5 Multiplex PCR products of partial Sa isolation strains after gel electrophoresis

2.5 PCR检测结果与表型比较 供试79株菌的菌落在显色平板上显粉红或紫红色且凝固酶阳性,但只有77株菌nuc基因扩增阳性。试验菌株基因型与表型符合率为97.47%。

由表2可知,β-内酰胺酶阳性、blaZ 阳性和β-内酰胺酶阴性、blaZ阴性的符合率为60.76%(48/79);对PEN、AMP同时耐药、blaZ阳性和对PEN、AMP同时敏感、blaZ阴性的菌株占75.95%(60/79),对青霉素类(PEN、AMP)敏感性分析结果、β-内酰胺酶试验结果和blaZ扩增结果同时符合的菌株占49.37%(39/79)。

表2 blaZ扩增结果与β-内酰胺酶试验和对青霉素类敏感性结果对比分析Table 2 Comparison of blaZ gene detection using PCR,β lactamase assay and penicillins sensitivity test

将blaZ扩增结果与菌株对青霉素类药物的最低抑菌浓度(MICs)进行对比分析,见表3。随着MICs增加blaZ阳性和blaZ阴性菌株数之间并没有什么相关性,无论MICs值大小,总有blaZ阳性和blaZ阴性菌株同时存在,blaZ阳性菌株数总是多于blaZ阴性菌株数。

药敏试验结果表明,食源79株Sa对测试的3种头孢菌素均为100%敏感。测定对苯唑西林的敏感性即是代替甲氧西林,苯唑西林药敏结果显示菌株的 MICs值在0.03～0.25μ g/mL之间,没有检出苯唑西林耐药的Sa,而79株Sa的mecA PCR检测结果均为阴性,表明无MRSA检出。因此,耐甲氧西林的基因与表型检测结果完全相符。

3 讨 论

3.1 检测Sa的nuc、blaZ和mecA基因多重PCR方法的建立 引物设计是PCR实验成功的关键。本实验设计的同时扩增nuc、blaZ和mecA基因的3对引物具有特异性。由于三个目标片段的大小差异较大,一定程度上增加了实验的难度,但通过对扩增体系和扩增参数的逐一优化,成功建立了扩增nuc、blaZ和mecA基因的三重PCR方法。该方法简便、快捷、准确,不仅能快速鉴定Sa,也能检测MRSA,更主要的是还能一定程度阐明Sa对β-内酰胺类抗生素的耐药机制,这点优越于其他多重 PCR方法〔1-3〕。正由于扩增的 nuc、blaZ和mecA 基因目标片段的大小差异较大,还有望结合其它耐药基因、肠毒素基因进行多基因的同步扩增。

表3 不同MICs值条件下的blaZ阳性/blaZ阴性菌株数比较Table 3 Comparison of blaZ positive or negative strains at different MICs

3.2 Sa的nuc、blaZ和mecA基因检测结果与表型结果分析 Sa产生耐热核酸酶使菌落在含有甲苯胺蓝的显色平板上显红色,这是Sa重要的表型特征。Sa 的 nuc 基因〔8-9〕、血浆凝固酶(coa)基因〔10〕、16S rRNA〔11〕和耐药辅助(femA)基因〔12〕常被作为种特异性基因,尤其是 nuc〔8-9〕、f emA 基因〔12〕具有很高的种特异性。本实验也表明nuc基因与其表型具有较高的符合率为97.47%。

耐药性的产生与携带耐药相关基因有关。Sa对β-内酰胺类耐药主要有两种机制:一是产生β-内酰胺酶,破坏β-内酰胺环从而对青霉素类耐药,由blaZ基因编码;二是耐甲氧西林的菌株获得了mecA基因,编码新的青霉素结合蛋白 PBP2a〔13〕。目前临床报道的90%Sa都产生β-内酰胺酶,但Desj Simeoni报道猪肉生产链中分离的葡萄球菌中有63.6%菌株为blaZ阳性〔14〕。本实验中blaZ扩增阳性率为73.42%,相对较高。β-内酰胺酶试验结果和对青霉素类的敏感性结果与blaZ扩增结果的符合率分别为60.76%和75.95%,而三个试验结果(β-内酰胺酶实验,对青霉素类敏感性和blaZ扩增)同时符合率为49.37%。耐青霉素G、氨苄西林的菌株中也有blaZ扩增阴性的菌株,并且通过与MICs进行比较分析,不同 MICs值下几乎都有blaZ阳性和blaZ阴性菌株,且blaZ阳性菌株占优势,敏感性与blaZ扩增结果并没有必然相关性。这些结果也说明耐药表型分析和基因型分析各有侧重点,因而存在一定差异。其原因可能是,本试验菌株来源于食品源所受到的药物选择压力低,不同于临床分离菌株,对青霉素耐药的机制可能没被药物激活,抗性蛋白表达量低。文献表明对Sa耐青霉素G的表型和基因型比较,采用头孢硝噻吩直接测定β-内酰胺酶比琼脂平板稀释法药敏试验能更好的预测blaZ基因的存在,在处于临界MICs的Sa对青霉素的耐药性判定中,可能琼脂稀释法中使用的耐药折点值太高,因为使用这种方法40%携带blaZ基因的菌株被列为敏感株〔15〕。也有可能对于表型测试阳性而blaZ阴性的菌株还有其它的耐药机制(如生物膜、主动外排)起了作用。

mecA是甲氧西林耐药决定子,79株食源Sa的mecA基因检测和表型耐药监测结果均为阴性,符合率100%,也表明此次检测动物性食品源Sa中无MRSA。目前动物性食品中MRSA的扩散传播较少〔4,16〕,故产生 β-内酰胺酶是对青霉素类耐药的主要原因,本实验结果与之一致。

目前,养殖业中仍存在滥用抗生素、食品中耐药细菌危险性逐步增高,给人类健康造成较大危害,由于食源性Sa呈现出不一样的耐药特性,本研究为加强动物性食品源Sa尤其MRSA的耐药性检测和连续监测提供了技术保障,掌握其发生变化趋势,为食品源Sa的安全评价提供有力支持。

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