基于HPLC-AFS联用法测定地龙蛋白粉中形态砷的前处理方法优化

王剑

（宁夏食品质量监督检验二站，宁夏 银川750001）

砷是一种可致癌类金属元素，以各种形态存在于自然界中[1]。砷在土壤中主要以三价砷As3+、五价砷As5+、一甲基砷(MMA)和二甲基砷(DMA)的形态存在，海洋产品中主要存在的形态砷是砷甜菜碱(AsB)和砷胆碱(AsC)[2]。无机砷通常是通过食物链进入人体，食物在消化时含有的砷化合物破坏了人体内酶的活性，进而造成基因突变及变异，从而导致癌症[3]。

地龙又名蚯蚓，生存于土壤中，地龙蛋白粉中含有机砷，原因是无机砷在动物体内的正常代谢过程中会发生甲基化，形成一甲基砷或二甲基砷[4]。作为我国传统中药，其药用价值随着新药效的发现而不断提升，促使其被砷污染情况越来越得到重视。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

实验仪器及设备见表1。

实验原料及试剂见表2。

实验所需器具及耗材：微孔滤膜（有机相），0.45μm；C18小柱；具塞离心管50mL。

1.2 试剂溶液配制

见表3。

1.3 混合标准使用液

1.3.1 标准中间液

见表4。

1.3.2 混合标准使用液

分别吸取As3+中间液、As5+中间液、MMA中间液与DMA中间液各0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00mL、2.50mL于25mL容量瓶配制出10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL的混合标准使用液，用流动相定容，摇匀。

表1 仪器设备一览表

表2 实验原料及试剂

表3 试剂溶液配制

表4 标准中间液的配制

2 试验方法

2.1 仪器参数

见表5。

表5 HJPLC-AFS仪器参数

2.2 样品的制备

准确称取1.0 g（精确至0.001 g）试样于50mL离心管中，加入20mL硝酸（0.05mol/L）溶液，静置过夜。于60℃恒温箱中浸提1 h，每半小时取出混匀一次。取出，冷却至室温，离心15min，转速为8000r/min，取5mL上清液置于离心管中，加入5mL正己烷，振摇，静置，弃去上层正己烷，收集提取液，经0.45μm有机滤膜过滤，测定。

2.3 定性试验

取四种形态砷的标准中间液稀释为40 ng/mL浓度的单标溶液，依次测定，在仪器设定识别四种形态砷后，取配置好的中间浓度的混标(40 ng/mL)溶液进行测定。确定每种形态砷的保留时间。

图1 四种单标溶液谱图

2.4 标准曲线的绘制

将配制好的10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL的混合标准使用液，进行上机测定。得出结果以标液浓度为x轴，以目标物峰面积为y轴，绘制出标准曲线，如图2—图5。

图2 三价砷标准曲线

图3 二甲基砷标准曲线

图4 一甲基砷标准曲线

图5 五价砷标准曲线

由图2、图3、图4、图5可知，四种形态砷均在10～100 ng/mL范围内呈现较良好的线性关系，相关系数均大于0.9980。

3 前处理条件的优化

3.1 提取液浓度

选取0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.15 mol/L和0.20mol/L的硝酸溶液进行试验，实验结果见表6和图6。

表6 不同提取液浓度的回收率

图6 提取液浓度的选择

由图6可知，在0.05～0.15mol/L范围内，回收率随着硝酸浓度的增加而增加，浓度为0.15mol/L和0.20mol/L时回收率变化平缓，故选择浓度为0.15 mol/L的硝酸溶液为提取液。

3.2 浸提时间

选取浸提时间1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h和3.5 h进行试验，实验结果见表7和图7。

表7 不同浸提时间的回收率

图7 恒温浸提时间的选择

由图7可知，在1～2.5 h范围内回收率随着浸提时间的增加而上升，浸提时间为2.5～3.5 h回收率变化平缓，故选择2.5 h作为浸提时间。

3.3 浸提温度

选取恒温浸提温度60℃、70℃、80℃、90℃和100℃进行试验，实验结果见表8和图8。

表8 不同浸提温度的回收率

图8 恒温浸提温度的选择

由图8可知，浸提温度在60℃、70℃时回收率过低，80℃回收率有部分未达标，100℃时提取状况很不稳定，形态砷会发生相互转换，故选择90℃为浸提温度。

3.4 正己烷去脂次数

选取正己烷1次、2次、3次去脂进行试验，实验结果见表9和图9。

由图9可知，去脂一次的回收率较低，说明油脂包裹待测物影响了检测结果，去脂两次与三次的回收率非常接近，在提取过程中发现，去脂两次后的正己烷有浑浊现象，去脂三次后的正己烷已近澄清，故选择正己烷去脂次数为两次。

表9 去脂次数与回收率的关系

图9 正己烷去脂次数的选择

4 结论

本论文通过对提取剂浓度、浸提时间、浸提温度、去脂次数、等前处理方法进行优化，建立了应用HPLC-AFS法对地龙蛋白粉中As3+、As5+、MMA和DMA四种砷形态分析的前处理方法。该方法优化为：提取剂选择0.15mol/L硝酸溶液，恒温浸提时间选择2.5小时，浸提温度选择90℃，正己烷去脂两次，三价砷回收率为98%、二甲基砷回收率为93%、一甲基砷回收率为94%、五价砷回收率为101%，可应用推广。