PDK1、IL12RB1和TCL1A基因多态性与西藏世居人群高原红细胞增多症易感性分析

陈 辉，杨雪林，张致英，张 寒，马福才，渠敬锋，普 赤，刘丽军，康龙丽

0 引 言

高原红细胞增多症(high altitude polycythemia, HAPC)是人类在长期处于高于2500米高海拔环境中，由高原低氧引起的红细胞代偿性过度增生，导致血液黏稠度升高、血流阻力增加的一种慢性高原疾病[1]。细胞内氧含量的差异会导致疾病的发生从而引起相应症状[2]。HAPC会侵犯皮肤黏膜，导致患者口唇、两颊、鼻尖、耳垂、手掌、指甲等多部位出现皮肤黏膜青紫，呈“多血貌”征[3]；当累及心血管、呼吸、神经等多个系统时，会出现头痛、心悸、呼吸困难、失眠等多种症状[4-5]，严重危害世居西藏人群身体健康。高海拔人群之间适应模式存在一定差异，表明在一定程度上，这种适应存在不同的遗传机制。PENG等[6]描述了参与HIF途径的EPAS1和EGLN1基因可能是高海拔遗传适应的候选基因。FAN等[7]通过全外显子测序，发现在西藏世居人群中PIK3CD和COL4A3基因上存在差异SNP位点。ZHOU等[8]通过全基因组关联研究，发现红细胞生成调节基因SENP1和癌基因ANP32D在患有慢性高原疾病的患者中表达上调。在不同人群中，HAPC疾病的候选基因不一定相同，连锁不平衡分析结果在不同人群中的表现也不一定相同。本研究前期发现西藏世居人群中存在可能的HAPC易感基因PDK1、IL12RB1和TCL1A。因此，本研究旨在通过靶向测序探寻PDK1、IL12RB1和TCL1A基因多态性与西藏世居人群HAPC的易感性关系，从而为西藏世居人群HAPC发病机制研究提供依据，探寻HAPC发生的危险因素。

1 资料与方法

1.1 研究对象回顾性收集2016年9月至2018年9月西藏民族大学附属医院和西藏自治区第二人民医院高原病及心血管内科和检验科567例就诊的HAPC患者为HAPC组，其中男455例，女112例。纳入标准：长期居住于海拔高于3650米的青藏高原西藏世居人群；为三代以内无血缘关系的独立个体；所有患者符合“青海标准”[1]；由两名副高及以上临床医师进行确诊；男Hb≥21 g/dL，女Hb≥19 g/dL。排除标准：慢性病导致继发性红细胞增多患者。同时选取360例健康体检人员作为对照组，其中男248例，女112例。本研究获得西藏民族大学伦理委员会的批准(批准号：201801)，所有受试者均签署知情同意书。

1.2提取DNA采集研究对象静脉血液样本2～3 mL，置于含有乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，使用TIANamp血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，中国北京)从外周血中提取适合测序的高质量基因组DNA。测定提取的DNA浓度、纯度及质量，合格样本置于-20 ℃冰箱中保存。

1.3靶向测序及基因分型选择PDK1、IL12RB1和TCL1A的蛋白质编码序列，优化多重 PCR panel 中的引物组成及浓度，以 2×150 bp 的双端测序模式在Illumina Hiseq(Illumina, CA, USA)平台进行高通量靶向测序。测序数据质量由FastQC确定，每个样品的平均覆盖深度至少是200X，碱基Q30比例>94%。对所有HAPC组和对照组中PDK1、IL12RB1和TCL1A基因 SNP进行基因分型。在HAPC组和对照组中，与HAPC显著相关的基因型变异被分型。5%重复样本的符合率在99%以上。

1.4生物信息学分析采用病例对照研究方法，评价西藏世居人群PDK1、IL12RB1和TCL1A基因与HAPC的关系。筛选SNP的标准为最小等位基因频率(minor allele frequency, MAF)≥0.05。用Plink进行遗传关联分析和比值比(OR)计算，基因型位点多态性与疾病发生的风险性用OR及其95%可信区间(95%CI)表示。采用显性模型、隐性模型和加性模型3种遗传模型对SNP位点进行Logistic回归分析。并对每个基因位点使用 Haploviewv4.2软件进行连锁不平衡分析，从而获得存在较强关联性的单倍型。

1.5统计学分析采用SPSS 23.0及R 3.6.0软件进行数据统计处理。HAPC组和对照组之间等位基因和基因型频率的Hardy-Weinberg平衡(HWE)，用标准拟合优度的χ2检验进行验证。组间比较采用独立样本t检验。Fisher′s精确检验分析两组间等位基因分布的差异。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1PDK1、IL12RB1和TCL1A基因SNP位点的Hardy-Weinberg检验所有样本共检测出突变位点32个，归纳各突变位点的基因富集区，包括内含子区(intronic)、外显子区(exonic)、3′-UTR、剪切位点区(splicing)、基因上游区(upstream)、基因下游区(downstream)、基因间区(intergenic)突变等。2组MAF值均≥0.05，故所有SNPs符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。说明PDK1、IL12RB1和TCL1A基因共计32个位点与HAPC存在关联，符合分型标准。其中PDK1基因存在8个SNPs，IL12RB1基因存在15个SNPs，TCL1A基因存在9个SNPs。

2.2差异SNP位点的关联分析对上述32个SNPs位点进行分析显示，PDK1和TCL1A基因的SNP位点差异无统计学意义(P>0.05)，但IL12RB1基因的rs393548、rs436857及rs845380位点与HAPC有关(P<0.05)。进一步对有关的3个SNPs进一步分析，共筛选出3个SNPs位点具有统计学意义：总体样本存在IL12RB1基因SNPrs393548和rs436857，女性样本中存在IL12RB1基因rs845380。在经过FDR校正或Bonferroni校正后，上述SNP均不存在统计学差异(P>0.05)。见表1。

表 1 Fisher′s精确检验筛选出的3个SNPs基因型频率统计

2.3差异SNP位点的遗传模型分析根据性别状况对IL12RB1基因rs393548、rs436857和 rs845380 进行分层处理并结合遗传模型分析。总体样本水平，rs393548和rs436857在显性模型和加性模型分析均与HAPC易感性增加有关(P<0.05)。在女性样本水平，HAPC保护因素是SNP rs845380，在隐性模型和加性模型分析均与HAPC保护性增加有关(P<0.05)。在男性样本水平，rs393548只在显性模型中显示出对HAPC的危险因素(P<0.05)。见表2。

表 2 3个SNPs在显性模型、隐性模型和加性模型中的关联结果

2.3PDK1、IL12RB1和TCL1A基因SNP位点连锁不平衡分析与单倍型分析

2.3.1PDK1基因对PDK1基因的8个SNPs进行连锁不平衡分析显示，一个单倍型域由这8个SNPs共同组成。而在进行单倍型分析后，HAPC组和对照组之间单倍型域的单倍型频率差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表 3 PDK1基因单倍型频率及其与HAPC风险的相关性

2.3.2IL12RB1基因对IL12RB1基因的15个SNPs进行连锁不平衡分析显示出五个单倍型域，第1个由rs3833286和rs3746190组成，第2个由rs3746190, rs12461312, rs17882555和rs383483组成，第3个由rs401502, rs375947, rs845380, rs845381, rs17852635, rs11575934和rs11086087组成，第4个由rs436857和rs393548组成，第5个由rs393548和SNV00212组成。其余SNP在单倍型域之外。在进行单倍型分析后，发现5个单倍型域中，第4个和第5个Block在HAPC组和对照组之间单倍型频率差异有统计学意义(P<0.05)，其余单倍型域的单倍型频率差异无统计学意义(P>0.05)。见图1，表4。

图 1 IL12RB1基因SNPs之间的成对连锁不平衡图

表 4 IL12RB1基因单倍型频率与HAPC风险的相关性

2.3.3TCL1A基因对TCL1A基因的9个SNPs进行连锁不平衡分析，可以观察到两个单倍型域，Block1由rs17093294、rs79582761、rs77796335、rs150271502和rs11846938组成，Block2由rs150271502, rs11846938, rs2887399和rs139012944组成。另外2个SNPs在单倍型域之外，其单倍型频率在HAPC组和对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表 5 TCL1A基因单倍型频率及其与HAPC风险的相关性

通过PDK1、IL12RB1和TCL1A基因共计32个SNPs位点的连锁不平衡分析，并结合单倍型分析，显示IL12RB1基因的SNP位点rs436857和rs393548，以及rs393548和SNV00212之间存在较高的连锁不平衡，差异有统计学意义(D'>0.9)；IL12RB1基因构建具有统计学意义的单倍型域中, A-A单倍型以及A--单倍型HAPC发病的危险因素(P<0.05)。

3 讨 论

课题组前期对生活在西藏海拔3650米地区的高原人群进行全外显子测序分析发现，PDK1、IL12RB1和TCL1A基因可能与高原人群的HAPC发生相关。本研究采取目标基因靶向测序技术，分析西藏世居人群病例对照组之间基因多态性差异及其与HAPC易感性的关系。我们从567例HAPC患者和360例健康志愿者的血液样本中筛选出IL12RB1基因上存在与HAPC相关的3个SNPs，其中rs393548和rs436857与西藏世居人群HAPC易感性增加有关，而rs845380是可能的保护性因素。此外，IL12RB1基因的SNP位点间构成了可能是HAPC危险因素的A-A单倍型和A--单倍型。而在本次实验中，没有发现PDK1和TCL1A基因多态性与西藏世居人群HAPC易感性的直接关系。

关键细胞因子基因的遗传变异可能会导致免疫应答失衡，从而影响人体的健康状况。IL12RB1基因位于染色体19p13.1上，大小约为28 kb，是人类对抗细胞内病原体产生抵抗力所介导的细胞因子的基因[9]。IL12RB1基因发生遗传变异可能是通过降低对IL-12和IL-23的受体反应性，产生相关下游效应，而使个体更容易患病[10-11]。T细胞在IL12RB1正常的情况下可通过增强IFNG的表达发挥抵御病原体的作用[12]。当IL12RB1双等位基因1623_1624delinsTT突变时，会发生一种免疫缺陷综合征，表现为对沙门氏菌、分枝杆菌和真菌感染等的增加[13]。在本研究中，首次发现IL12RB1基因rs393548和rs436857是HAPC的危险因素，rs845380是女性人群的保护因素。Song等[14]发现高危人乳头瘤病毒(hrHPV)感染患者的血清IL-12水平显著低于健康对照者(P<0.01)，但病例对照研究显示rs436857和rs393548等位基因频率无显著差异。说明IL12RB1基因rs393548和rs436857并不在所有疾病中都显著表达，SNPs导致的IL-12的变化对西藏世居人群HAPC的易感性可能具有一定影响。尽管本研究差异位点在初次经过 FDR/Bonferroni校正后不存在统计学意义，但进行后续差异基因SNP位点连锁不平衡分析与单倍型分析后，此处几个位点在组间表现出显著性差异并形成了具有统计学意义的单倍型域。我们推测差异位点之间可能存在相互作用，导致单一位点差异性经校正后出现不显著的情况，并不否认此处几个位点的表达差异。

缺氧环境会导致IL-1β、TNF-α等多种细胞因子水平发生改变[15]。HAPC患者血清炎性细胞因子水平变化，存在IL-1β、IL-2、IL-15、TNF-α等多种参与调控EPO和HIF-1α等相关因素，当反应失调会造成机体氧自由基代谢紊乱，导致细胞增殖、凋亡和坏死，出现炎性疾病，最终导致HAPC的发生[16]。HIF-1α在缺氧相关基因的转录及表达活性的调控中起重要作用[17]。Shan等[18]在乳酸对巨噬细胞免疫功能的实验中提到，HIF-1α信号通路中可能有IL-12表达下调的作用效果。我们发现可能是IL12RB1基因rs393548和rs436857位点的突变，影响了IL-12在HIF-1α信号通路正常发挥作用，导致患者体内HIF含量增加，代偿性导致红细胞增多的发生。Tian等[19]在性别与缺血性卒中的研究中指出，影响IL-12、HIF-1α表达的基因只在女性患者中发挥作用，炎性因子在某些疾病的表达存在性别差异。HAPC的流行病学调查指出，男性群体相较于女性群体更易患病[20]。我们认为可能是由于在女性IL12RB1基因rs845380引起的变化起到了保护性作用，而该SNP在男性不存在差异，因此对男性群体没有抵抗HAPC作用，从而出现男性群体患病率高于女性群体的现象。

人类PDK1基因位于染色体2q31.1，编码丙酮酸脱氢酶激酶1，在调节葡萄糖和脂肪酸代谢的体内平衡中发挥至关重要的作用[21]。抑制PDK1的表达使细胞中葡萄糖摄取增加和线粒体激活，导致活性氧(ROS)水平升高[22]。高原缺氧条件下ROS形成增多引起氧化应激[23]，我们推测其中的机制可能与PDK1低表达有关。西藏世居人群中ROS上调HIF-1α水平，其介导的HIF-1α信号与HAPC患者胃损伤的病理机制有关[24]。但我们在本次研究中没有发现PDK1基因上的显著SNP，可能是HAPC患者HIF表达并不和病情完全一致。而TCL1A基因属于TCL1家族的成员，位于染色体14q32.1[25]。该基因多态性的不同蛋白表达与性别差异有关。男性中，Y染色体嵌合体丢失(mLOY)患者的TCL1A基因rs2887399可能是疾病发生的危险因素[26]，mLOY与特殊的血液疾病有关，包括急性髓系白血病、骨髓增生异常综合征和白血病前期。女性中，雌二醇能诱导具有TCL1A基因 rs11849538变异序列的表达，产生功能性雌激素反应元件[27]。但我们没有发现TCL1A基因存在任何显著SNP，推测HAPC在西藏世居人群患病率的性别差异可能不是由TCL1A基因多态性引起。恶性血细胞大量积聚的原因可能与TCL1A基因表达失控有关[28]。HAPC患者存在红细胞的代偿性过度增生，但本次研究没有发现确切的TCL1A基因SNP，这可能是TCL1A基因在该疾病作用的位点过于分散，也可能是由于TCL1A基因单倍型存在人群特异性[29]，而本次选取的人群不存在TCL1A基因多态性差异。

综上，本研究进一步阐明HAPC遗传机制，发现IL12RB1基因rs393548、rs436857和rs845380位点与HAPC相关，而PDK1和TCL1A基因位点无明显关联。遗传易感性往往是多基因缺陷导致，不能排除多基因联合作用，这些位点具有深入跟踪研究的价值，并可能为世居西藏的高原人群健康生活提供指导依据。