时间:2024-07-28
孙家栋,李雪梅,刘君玲
神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童最为常见的恶性实体肿瘤,具有高发病率、高病死率、预后差等特点,近些年基因治疗、免疫生物治疗等成为研究热点[1]。肿瘤抑制因子圆柱瘤基因(cylindroma,CYLD)基因是2003年在Nature杂志报道的肿瘤抑制基因,在人体内广泛存在,作为一个去泛素化酶,可通过抑制JNK、NF-κB、Wnt/β-catenin等信号通路激活,从而在细胞周期调控、肿瘤发生抑制等事件中发挥重要作用[2-3]。近些年研究表明,CYLD与多种实体肿瘤发生密切相关[4-5]。CYLD在神经母细胞瘤研究极少,有研究发现,在神经母细胞瘤患者CYLD高表达,与总生存期延长、预后较好有关,且与分期呈现负相关[6]。CYLD对神经母细胞瘤细胞生物学特性及机制研究尚未清楚。因此,本研究以人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y为模型,将pcDNA3.1-CYLD质粒转染SH-SY5Y细胞,观察细胞活力、凋亡率情况,并进一步研究其对ROS及NF-κB信号通路的影响。
1.1 试剂和仪器DMEM培养基、FBS均购自美国Gibco;CYLD抗体、p52抗体、cyclinD1抗体和Bax抗体均购自美国CST;ROS检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自碧云天生物技术研究所;MTT购自美国Sigma;Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自南京凯基;酶标仪购自美国BioTek;流式细胞仪购自美国BD。
1.2细胞培养人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y购自中国科学院上海细胞库。细胞常规复苏后用在胎牛血清的DMEM培养基,在5% CO2、37 ℃培养箱中培养。2 d换1次培养液,细胞长满培养瓶壁即可传代。
1.3分组及转染将SH-SY5Y细胞分为3组,即空白组、pcDNA3.1组(转染空白pcDNA3.1质粒)和pcDNA3.1-CYLD组(转染pcDNA3.1-CYLD质粒)。其中pcDNA3.1-CYLD质粒及空白pcDNA3.1质粒均由上海吉玛完成。参照LipofectamineTM2000说明进行转染,简要步骤如下:含15% FBS、不含双抗的DMEM培养基将SH-SY5Y细胞以1.5×105/mL接种至24孔板,次日,将制备的质粒-Lipofectamine混合液缓慢加至孔内,每孔100 μL,前后摇动孔板,混匀后放入孵箱,48 h后,收集细胞,用于后续实验。
1.4Western blot检测CYLD、p52、cyclinD1和Bax蛋白表达pcDNA3.1-CYLD转染SH-SY5Y细胞48 h,适量的RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白,蛋白经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定后,每孔上样40 μg蛋白,经15% SDS-PAGE分离,电泳后电转PVDF膜,50 g/L的脱脂奶粉封闭膜2 h,洗膜,4 ℃孵育一抗(CYLD、p52、cyclinD1和Bax抗体,稀释比例均为1∶500)过夜,TBST洗膜,加HRP标记的二抗(稀释比例1∶2000),室温孵育1.5 h,TBST洗膜,暗处配置显影液,把胶片放入Bio-RadChemiDocXRS+化学发光成像系统,每胶片加300 μL显影液,显影后拷贝照片,使用Quantity One软件分析图像。以检测的目的蛋白与内参GAPDH灰度值比值为各蛋白相对表达量。实验重复3次。
1.5MTT法检测细胞活力收集 1.3 方法处理的各组细胞,以 4 × 103个/孔接种于 96 孔板,每孔 100 μL 培养基,于37 ℃培养箱过夜培养,待细胞生长贴壁后,每组设置5个平行孔,37 ℃培养24、48、72和96 h,加MTT(5 mg/mL)溶液,每孔20 μL,继续培养4 h,加DMSO,每孔100 μL,于培养箱内培养15 min,使结晶紫能充分溶解。96孔板置于酶标仪中,在490 nm波长测定各孔的吸光度值(A)。实验重复3次。
1.6流式细胞仪实验检测细胞凋亡率胰蛋白酶消化转染pcDNA3.1-CYLD 48 h的细胞,制备成细胞悬液,预冷PBS洗涤细胞,离心,去上清,细胞沉淀中加入Annexin-binding Buffer重悬细胞,细胞悬液中加5 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI,室温放于暗处反应15 min,使用流式细胞仪检测。实验重复3次。
1.7ROS检测采用活性氧检测试剂盒检测细胞内的ROS水平。PBS洗涤转染pcDNA3.1-CYLD 48 h的细胞,离心,去上清,加1 μL(10 mmol/L)荧光探针CM-H2DCFDA,使其终浓度为10 μmmol/L,37 ℃温箱孵育30 min,每隔3 min颠倒混匀1次,使用流式细胞仪检测。检测时使用488 nm激发波长和525 nm发射波长。实验重复3次。
2.1 CYLD在神经母细胞细胞中的表达Western blot结果显示,空白组、pcDNA3.1组和pcDNA3.1-CYLD组的蛋白表达分别为(0.074±0.010)、(0.089±0.012)和(0.787±0.067);pcDNA3.1-CYLD组CYLD表达明显高于pcDNA3.1组(P<0.05),见图1。
1:空白组; 2:pcDNA3.1组; 3:pcDNA3.1-CYLD组
2.2上调CYLD表达可抑制SH-SY5Y细胞活力SH-SY5Y细胞转染pcDNA3.1-CYLD质粒 24、48、72和96 h,pcDNA3.1-CYLD组细胞活力(48、72和96 h)明显低于pcDNA3.1组(P<0.05)。见图2。
与pcDNA3.1组比较,*P<0.05
2.3上调CYLD表达可促进SH-SY5Y细胞凋亡pcDNA3.1-CYLD质粒转染SH-SY5Y细胞,空白组、pcDNA3.1组和pcDNA3.1-CYLD组的细胞凋亡率分别为(4.41%±0.47%)、(4.23%±0.41%)和(21.36%±0.79%);pcDNA3.1-CYLD组细胞凋亡率明显高于pcDNA3.1组(P<0.05)。见图3。
2.4上调CYLD表达可诱导SH-SY5Y细胞ROS产生结果显示,空白组、pcDNA3.1组和pcDNA3.1-CYLD组的ROS荧光强度分别为(64.74±1.02)、(66.51±1.26)和(94.39±1.58);pcDNA3.1-CYLD组ROS荧光强度明显高于pcDNA3.1组(P<0.05)。
2.5上调CYLD表达可下调SH-SY5Y细胞NF-κB信号通路Western blot检测结果显示,与pcDNA3.1组比较,pcDNA3.1-CYLD组p52和cyclinD1蛋白表达明显降低(P<0.05),Bax蛋白表达明显升高(P<0.05),见图4,表1。
a:空白组; b:pcDNA3.1组; c:pcDNA3.1-CYLD组
1:空白组; 2:pcDNA3.1组; 3:pcDNA3.1-CYLD组
表 1 p52、cyclinD1和Bax的蛋白相对表达量
CYLD蛋白是新近发现的肿瘤抑制因子,可去泛素化p53、Bcl-3、TRAFs等信号分子,作用于JNK、NF-κB等多条信号通路,在多种实体肿瘤信号激活中起重要的调节作用[7-8]。研究表明,下调CYLD表达可增强人乳腺癌细胞生长和迁移能力[9]。miR-181b可通过上调CYLD表达诱导甲状腺癌细胞凋亡[10]。以上研究提示CYLD可以作为多种细胞瘤的生物标志物。本研究结果显示,上调CYLD表达可抑制神经母细胞瘤活力,诱导细胞凋亡,这与上述研究结果相似,提示CYLD可能是神经母细胞瘤分子治疗的一个有效靶点。
氧化应激是细胞内由于ROS产生过量引起的一种氧化-抗氧化体系失衡的应激损伤状态。ROS是一类有氧化还原潜能的氧衍生物,具有潜在的危险的细胞代谢副产物,可直接对细胞生长、衰老、癌症发展等产生影响[11-12]。有研究表明,过量ROS产生能对细胞DNA、蛋白质及脂质膜等各种重要成分造成损伤,进而导致肿瘤细胞凋亡[13]。近些年的大量研究表明,ROS可诱导肝癌、食管癌、神经母细胞瘤等多种肿瘤细胞凋亡[14-16]。本研究结果显示,上调CYLD表达可诱导神经母细胞瘤细胞ROS产生,提示诱导ROS产生可能是上调CYLD表达促进神经母细胞瘤凋亡的机制之一。
NF-κB信号是膜受体介导的信号转导途径之一,参与机体炎症反应、免疫调节、增殖、凋亡等生物学过程。在多种肿瘤(包括神经母细胞瘤)中可以被激活,参与肿瘤细胞的发生发展[17]。有研究报道,CYLD可以作为去泛素化酶可负性调节NF-κB信号通路[18]。CYLD基因缺失时,可诱发Bcl-3泛素化,使其在细胞核内聚集,且与NF-κB家族p52或p50结合,激活cyclinD1基因转录和表达,从而诱发肿瘤发生[19]。有研究表明,CYLD通过抑制NF-κB信号通路抑制了胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡[20]。过表达CYLD可通过抑制肺癌细胞NF-κB信号增强TRAIL的抗肿瘤活性[21]。本研究结果显示,上调CYLD表达可抑制p52和cyclinD1表达,上调Bax表达。
综上所述,上调CYLD表达可诱导神经母细胞瘤细胞凋亡,机制可能与提高细胞ROS水平及抑制NF-κB信号通路有关。目前关于CYLD在神经母细胞瘤中的研究较少,值得进一步深入探究。
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