SIRT3-FoxO1通路在H9c2心肌细胞缺血损伤中的作用

苏 冬, 林先和

0 引 言

心肌缺血是由于冠状动脉血流量减少、氧气供应受限，使心肌细胞的营养成分达不到正常代谢所需的要求，导致心肌细胞的正常功能受到影响，是一种临床上常见的病理过程[1]。临床上缺血性心脏病可能表现为心绞痛、急性冠状动脉综合征、心肌梗死、心脏猝死和心力衰竭等多种情况。缺血性心脏病的死亡率约占总死亡原因的12%，在35～74岁的人群中，心肌梗死是导致死亡的主要原因[2]。SIRT3属于III类组蛋白去乙酰化酶，当能量需求增加时会使其激活，在多种组织中表达，在心脏中高度表达。SIRT3主要存在于线粒体及细胞核中，被认为是最重要的去乙酰化酶，通过去乙酰化各种线粒体蛋白，如叉头盒O转录因子(forkhead box O, FOXO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 2,SOD2)等，调节线粒体动力学、代谢和细胞对氧化应激的反应等多种细胞生物学活性。而且SIRT3可以通过激活多种信号通路来调节自噬的进展，从而对细胞起到保护作用，其中包含AMPK-mTOR、Sirt3-FOXO、Sirt3-MnSOD等信号通路[3-4]。本研究以大鼠H9c2细胞为对象构建缺血缺氧模型，过表达SIRT3及添加SIRT3选择性抑制剂3-TYP，通过检测乙酰化FoxO1以及自噬相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达，并测定细胞凋亡率和LDH释放量，探讨SIRT3-FoxO1通路在心肌缺血缺氧以及自噬、凋亡过程中的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料H9c2大鼠心肌细胞(普诺赛公司)，3-TYP(GLPBIO公司)，大鼠源SIRT3慢病毒过表达包装[汉恒生物科技(上海)有限公司]，GAPDH抗体(Affinity公司)，SIRT3抗体(Affinity公司)，Ac-FoxO1抗体(ThermoFisher公司)，LC3B抗体(Cell Signaling公司)，Bcl-2抗体(Bioss公司)，Beclin1抗体(Cell Signaling公司)，Bax抗体(Abcam公司)，RT Master Mix(TaKaRa公司)，TRIzol Reagent(ambion公司)，AnnexinⅤ-APC/7-AAD荧光双染细胞凋亡检测试剂盒(Elabscience公司)。

使用仪器包括全自动生化分析仪(日立，3100)，流式分析细胞仪(贝克曼，Cyto-FLEX)，倒置荧光显微镜(蔡司，Axio Observer 3)，实时荧光定量PCR[罗氏，LC480II(96)]，凝胶成像系统(GE，AL600RGB)。

1.2实验方法

1.2.1 构建缺血缺氧模型将H9c2细胞种于6孔板中，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，并放入含5% CO2的37 ℃正常培养箱中培养。待细胞长满后，弃去6孔板中培养基并用PBS缓冲液清洗两遍，加无糖DMEM培养基并放入含94% N2、5% CO2、1% O2的37 ℃缺氧培养箱中培养，缺血缺氧9 h后进行后续实验。

1.2.2实验分组以H9c2大鼠心肌细胞为对象，用大鼠源SIRT3慢病毒感染H9c2细胞获得过表达SIRT3稳定细胞株(病毒滴度1×108TU/mL，MOI值为40)，用SIRT3选择性抑制剂3-TYP对过表达SIRT3细胞进行预处理。

实验分为4组：对照组(正常H9c2细胞长满后换高糖DMEM培养基，并放入正常培养箱中培养)、缺血缺氧组(正常H9c2细胞长满后换无糖DMEM培养基，并放入缺氧培养箱中培养)、过表达SIRT3+缺血缺氧组(过表达SIRT3细胞长满后换无糖DMEM培养基，并放入缺氧培养箱中培养)、过表达SIRT3+ 3-TYP+缺血缺氧组(过表达SIRT3细胞用3-TYP预处理后换无糖DMEM培养基，并放入缺氧培养箱中培养)。

1.2.3QPCR验证慢病毒感染效果慢病毒感染72 h后倒置显微镜观察感染率达80%左右，然后加嘌呤霉素进行药筛约48 h，药筛后收集过表达SIRT3的细胞株并进行传代，因此慢病毒感染7～10 d后用QPCR验证SIRT3过表达情况。

按照试剂盒说明书用Trizol试剂提取细胞RNA，测定RNA浓度，并逆转录合成cDNA，荧光定量试剂盒进行QPCR反应，内参选用β-actin。引物序列为：sirt3-F，5′-GGTCCAGCTAGGGGATGTAGT-3′；sirt3-R，5′-CCCGCAGGTGAAGAAGTAAG-3′。

1.2.4乳酸脱氢酶(LDH)测定4组细胞进行实验处理后，分别提取培养基上清离心并做好标记，使用日立3100生化分析仪对上清进行LDH测定。

1.2.5流式荧光细胞术检测细胞凋亡按照AnnexinⅤ-APC/7-AAD荧光双染细胞凋亡检测试剂盒说明书，将细胞消化洗涤并加入不同染色液孵育后制成样品，然后用流式分析细胞仪分析各组细胞的凋亡率。

1.2.6Westernblot法检测蛋白表达用细胞裂解液提取蛋白后，根据目的蛋白的分子量大小分别用10%和15%的SDS-PAGE凝胶对蛋白样本进行电泳，转膜并用5%脱脂牛奶封闭后，4 ℃下与SIRT3、乙酰化FoxO1、LC3B、Beclin1、Bax、Bcl2一抗(1∶1000)孵育过夜，第2天用TBST缓冲液洗涤后再用二抗(1∶3000)室温孵育1.5 h，最后显影。

2 结 果

2.1 慢病毒构建过表达SIRT3细胞株结果

2.1.1 倒置显微镜观察荧光结果用慢病毒感染正常H9c2细胞48 h后，用倒置显微镜观察细胞感染效率，感染率以及荧光亮度较低；感染72 h后，感染率以及荧光亮度明显增强，感染率达80%左右。见图1。

2.1.2QPCR检测SIRT3过表达结果QPCR结果显示，慢病毒感染后SIRT3相对表达量(1.37±0.07)较正常细胞(1.00±0.06)明显增加(P<0.01)。

2.2LDH测定结果过表达SIRT3+缺血缺氧组LDH释放量[(58.67±5.13)U/L]、对照组LDH释放量[(28.33±8.50)U/L]较缺血缺氧组[(118.00±19.70)U/L]明显降低(P<0.01)，过表达SIRT3+ 3-TYP+缺血缺氧组LDH释放量[(95.33±13.05)U/L]较过表达SIRT3+缺血缺氧组明显升高(P<0.01)。见图2。

2.3流式荧光细胞术检测细胞凋亡结果过表达SIRT3+缺血缺氧组细胞凋亡[(19.96±1.58)%]、对照组细胞凋亡[(11.60±3.28)%]较缺血缺氧组[(28.41±2.62)%]明显降低(P<0.01)，过表达SIRT3+ 3-TYP+缺血缺氧组细胞凋亡[(27.92±2.27)%]较过表达SIRT3+缺血缺氧组明显升高(P<0.01)。见图3。

a：对照组；b：缺血缺氧组；c：过表达SIRT3+缺血缺氧组；d：过表达SIRT3+ 3-TYP+缺血缺氧组

2.4Western Blot法检测蛋白表达结果

2.4.1 SIRT3/FoxO1通路蛋白表达情况Western blot结果显示，过表达SIRT3+缺血缺氧组、对照组SIRT3蛋白表达较缺血缺氧组明显增加(P<0.05)，乙酰化FoxO1蛋白表达明显减少(P<0.05)。过表达SIRT3+3-TYP+缺血缺氧组乙酰化FoxO1蛋白表达较过表达SIRT3+缺血缺氧组明显增加(P<0.05)。见图4，表1。

1：对照组；2：缺血缺氧组；3：过表达SIRT3+缺血缺氧组；4：过表达SIRT3+ 3-TYP+缺血缺氧组

2.4.2自噬相关蛋白LC3B、Beclin1表达情况Western blot结果显示，过表达SIRT3+缺血缺氧组LC3B蛋白、Beclin1蛋白表达较缺血缺氧组明显增加(P<0.05)，缺血缺氧组较对照组明显增加(P<0.05)，过表达SIRT3+ 3-TYP+缺血缺氧组较过表达SIRT3+缺血缺氧组明显减少(P<0.05)。见图5，表1。

表 1 各组蛋白的表达情况比较

1：对照组；2：缺血缺氧组；3：过表达SIRT3+缺血缺氧组；4：过表达SIRT3+ 3-TYP+缺血缺氧组

2.4.3凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达情况Western blot结果显示，过表达SIRT3+缺血缺氧组、对照组Bax蛋白表达较缺血缺氧组明显减少(P<0.05)，过表达SIRT3+ 3-TYP+缺血缺氧组较过表达SIRT3+缺血缺氧组明显增加(P<0.05)。过表达SIRT3+缺血缺氧组、对照组Bcl-2蛋白表达较缺血缺氧组明显增加(P<0.05)，过表达SIRT3+ 3-TYP+缺血缺氧组较过表达SIRT3+缺血缺氧组明显减少(P<0.01)。见图6。

1：对照组；2：缺血缺氧组；3：过表达SIRT3+缺血缺氧组；4：过表达SIRT3+ 3-TYP+缺血缺氧组

3 讨 论

本研究结果显示，过表达SIRT3基因使自噬相关蛋白LC3B、Beclin1增加，促凋亡蛋白Bax减少而抗凋亡蛋白Bcl-2增加，细胞凋亡率和LDH释放量减少，由此得出过表达SIRT3通过自噬和凋亡的调控对缺血缺氧的H9c2细胞具有保护作用；而当使用SIRT3选择性抑制剂3-TYP预处理时，SIRT3的表达量并未出现明显改变，但自噬相关蛋白LC3B、Beclin1表达量有所减少，促凋亡蛋白Bax增加而抗凋亡蛋白Bcl-2减少，细胞凋亡率和LDH释放量增加，由此得出3-TYP虽然不改变SIRT3表达量，但使其活性受到抑制，取消了SIRT3对缺血缺氧的H9c2细胞的保护作用。此外，本研究Ac-FoxO1蛋白表达结果显示，缺血缺氧时Ac-FoxO1表达量增加，过表达SIRT3后Ac-FoxO1表达量减少，而添加3-TYP后Ac-FoxO1表达量有所增加。由此说明，SIRT3对于自噬、凋亡和缺血心肌细胞的影响可能是部分通过对FoxO1的去乙酰化作用完成的。

心肌缺血时导致心肌细胞缺氧以及营养物质不足，从而出现代谢异常、异常代谢产物在细胞内堆积，使ATP生成受损，活性氧的生成增加，触发自噬过程，降解细胞内的异常物质以及受损的细胞器等，使其成为能被细胞重新利用的小分子物质，以此维持代谢需求和支持大分子物质生物合成，从而维持细胞和机体的正常状态和功能[5-6]。心肌缺血时细胞内的自噬和凋亡过程会发生一系列的改变从而造成损伤，有研究表明一些中西药可以调节自噬和凋亡对缺血的心肌具有保护作用[7-8]。FoxO1是叉头盒转录因子家族的一员，心肌缺血导致的能量不足、氧化应激等刺激使FoxO1乙酰化并抑制其活性；而SIRT3作为一种重要的去乙酰化酶可以在心肌缺血刺激时调节其乙酰化进程，从而促进抗氧化基因和自噬的表达并抑制凋亡，使细胞在氧化应激等刺激下得以维持正常状态和功能[9-10]。

有研究指出，SIRT3使ROS减少从而改善心肌肥厚[11]，且SIRT3的激活可以通过减少FoxO1的乙酰化促进自噬使心肌肥厚得到减轻[12]。与心肌肥厚病理机制类似，心肌缺血也使ROS生成量增加并诱发自噬过程，而本研究也证实，在H9c2细胞缺血缺氧模型中，过表达SIRT3可以调节FoxO1的乙酰化从而改变自噬通量对缺血细胞起到保护作用。另外，Sirtuins与FoxO具有多种亚型，两者之间存在着及其复杂的联系和作用，并且都对自噬起到重要的调控作用[13]，因此需要对FoxO和SIRT3进行后续研究。

综上所述，本研究结果表明SIRT3-FoxO1通路在H9c2心肌细胞缺血损伤中通过改变自噬和凋亡起到保护作用，为心肌缺血损伤的可能机制提出了新的思路，对心肌缺血和自噬的的进一步研究，加深了对于心肌缺血的理解也为其治疗提供了可能的机制基础。