LINC00205靶向miR-514a-3p/NF-κB对血管平滑肌细胞生物学功能的作用

张闻伯，高新梅，王 喆，和传波，赵 强

0 引 言

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是临床常见的一种心血管疾病，其发生率逐年上升，人主动脉血管平滑肌细胞增殖、迁移是动脉粥样硬化等心血管疾病的病理基础。目前AS发病机制尚未阐明，因此明确AS的确切发病机制并展开积极的防控措施具有重要的临床价值[1-2]。长链非编码RNA(LncRNA)在ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞中表达异常并可调控细胞增殖及凋亡[3]。LINC00205通过靶向miR-122-5p促进肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭[4]。但LINC00205对血管紧张素II(angiotensin II, AngII)诱导的血管平滑肌细胞表型转化的影响尚未可知。靶基因预测显示微小RNA-514a-3p(miR-514a-3p)与LINC00205存在结合位点，LncRNA LUCAT1通过调节miR-514a-3p/ULK1轴而促进非小细胞肺癌顺铂耐药[5]，LINC00205 可以通过抑制肝细胞癌的miR-184 来调节环氧化物水解酶表达，为肝细胞癌治疗提供方案[6]。已有研究表明miR-514a-3p通过调控细胞核因子κB(nuclear factor kappa gene binding，NF-κB)通路从而参与肿瘤发生过程，与 miR-514a-3p调控NF-κB抑制细胞凋亡有关[7]。但LINC00205是否调控miR-514a-3p/NF-κB通路而参与AS发生过程尚未清楚。因此，本研究采用AngII诱导的血管平滑肌细胞建立动脉粥样硬化模型，分析LINC00205/miR-514a-3p/NF-κB分子轴在血管平滑肌组织中发挥的作用及机制，为后续临床提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂人主动脉血管平滑肌细胞HA-VSMC(美国ATCC细胞库)，AngII(美国Millipore Corporation)，DMEM(美国Gibco)，Lipofectamine2000、Trizol试剂(购自USA，Thermo Fisher公司)，反转录和荧光定量PCR试剂(购自北京天根生化公司)，si-con、si-LINC00205、miR-con、miR-514a-3p mimics、anti-miR-con、anti-miR-514a-3p(购自广州锐博生物公司)，MTT试剂、凋亡检测试剂(北京索莱宝)，Transwell小室(美国Corning)，兔抗人CyclinD1、MMP2、MMP9、Cleaved-caspase-3抗体(美国Santa Cruz)，兔抗人p-p65、p-IкBα抗体(北京百奥莱博)，山羊抗兔IgG二抗(购自USA，Abcam)。

1.2细胞学实验

1.2.1 实验分组HA-VSMC细胞(1×105个/mL)接种于96孔板(100 μL/孔)，加入含10-5mmol/L AngII的培养液培养48 h[8]，为AngII组。同时将正常培养的细胞作为正常组。将si-con、si-LINC00205、miR-con、miR-514a-3p mimics、anti-miR-con、anti-miR-514a-3p及si-LINC00205与anti-miR-con、si-LINC00205与anti-miR-514a-3p转染至HA-VSMC细胞后加入含10-5mmol/L AngII的培养液培养48 h，分别为si-con组、si-LINC00205组、miR-con组、miR-514a-3p组、anti-miR-con组、anti-miR-514a-3p组、si-LINC00205+anti-miR-con组、si-LINC00205+anti-miR-514a-3p组。

1.2.2qRT-PCR法检验LINC00205与miR-514a-3p表达情况HA-VSMC细胞的总RNA使用Trizol法获得。反转录体系为：5×gDNA Buffer(2 μL)→10×King RT Buffer(2 μL)→FastKing RT Enzyme Mix(1 μL)→FQ-RT Primer Mix(2 μL)→RNA(2 μg)→补足RNase-Free ddH2O(需达到20 μL)。反应体系具体配置方法和反应程序均参考说明书进行，LINC00205与miR-514a-3p的表达情况通过罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪获得，具体操作流程参考说明书进行。

1.2.3MTT检测细胞增殖各组HA-VSMC细胞(1×105个/mL)接种于96孔板(100 μL/孔)后继续培养24 h，加入MTT溶液(20 μL/孔)后室温孵育4 h，剔除上部清液后，每孔滴入150 μL DMSO，常温静置5 min，使用酶标仪检验吸光度值，即A值。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡率取各组HA-VSMC细胞加入预冷PBS，清洗完成后剔除上部清液，滴入结合缓冲液，用量为500 μL。然后在悬浮细胞中分别加入Annexin V-FITC和PI，用量均为5 μL，常温静置10 min检验细胞凋亡率，检验设备为FACS Calibur流式细胞仪。

1.2.5Transwell实验检测细胞迁移将各组HA-VSMC细胞悬液(2×104个/mL)加入小室的上室(200 μL/孔)，在下室中置入培养液(用量为600 μL)后放入培养箱内培养，培养周期为24 h，培养结束后使用甲醛固定，静置20 min，使用结晶紫染液(浓度为0.1%)染色，静置10 min后通过显微镜查看迁移细胞数并记录。

1.2.6LINC00205与miR-514a-3p间靶向关系的检验经Starbase检验证明LINC00205和miR-514a-3p有结合位点，建立突变型载体(MUT-LINC00205)和野生型载体(WT-LINC00205)，然后与miR-con、miR-514a-3p mimics同时转染到HA-VSMC细胞中，常温培养24 h，观察看荧光素酶活性。

1.2.7CyclinD1、MMP2、MMP9、Cleaved-caspase-3、p-p65、p-IкBα、p65、IкBα各蛋白表达情况的检验将500 μL RIPA裂解液滴入HA-VSMC细胞中，获得细胞总蛋白，经BCA法察看蛋白浓度后分离蛋白，然后转膜并封闭2 h，封闭完成后加入比例为1∶2000的一抗稀释液和二抗稀释液，常温静置60 min，检验条带灰度值，检验软件为ImageJ。

1.3动物学实验

1.3.1 实验动物及分组将健康级大鼠20只(购自济南朋悦试验动物繁殖有限公司)，动物生产许可证号：SCXK(鲁)2014-0007，雌雄各半，随机分为对照组和AS组，每组10只。其中对照组给予普通饲料喂养，AS组给予含有蛋氨酸2%的饲料喂养，持续喂养4周，建立AS模型。动物试验全过程均符合动物3R原则。实验室饲养环境：清洁环境，相对湿度50%～70%，室温22～26 ℃，白昼交替，自由摄食饮水。

1.3.2颈动脉内膜中膜厚度安乐处死大鼠，切开颈部，取左侧颈动脉，采用液氮研磨，加入RIPA裂解液充分裂解，4 ℃ 10 000 r/min离心15 min，取上清，以BCA试剂盒测定蛋白纯度。采用1.2.7方法检测颈动脉LINC00205、miR-514a-3p、p-p65、p-IкBα、p65、IкBα蛋白的表达。

2 结 果

2.1 HA-VSMC细胞中LINC00205、miR-514a-3p的表达情况与正常组LINC00205蛋白、miR-514a-3p蛋白表达[(1.00±0.10)、(1.04±0.13)]比较，AngII组[(2.69±0.24)、(0.21±0.05)]明显升高(P<0.05)。

2.2低表达LINC00205对HA-VSMC细胞增殖的影响与正常组比较，AngII组A值明显升高[(1.01±0.10)vs(1.46±0.12),P<0.05]；与si-con组比较，si-LINC00205组A值降低[(1.48±0.13)vs(1.08±0.09),P<0.05]。

2.3低表达LINC00205对HA-VSMC细胞凋亡的影响与正常组凋亡率比较，AngII组明显降低(P<0.05)；与si-con组凋亡率比较，si-LINC00205组明显升高(P<0.05)。见图1。

图 1 低表达LINC00205对HA-VSMC细胞凋亡的影响

2.4低表达LINC00205对HA-VSMC细胞迁移的影响与正常组HA-VSMC细胞迁移数比较，AngII组明显升高[(67±6)vs(153±14),P<0.05]；与si-con组HA-VSMC细胞迁移数比较，si-LINC00205组明显降低[(158±15)vs(72±7),P<0.05]。

2.5低表达LINC00205对HA-VSMC细胞CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达的影响与正常组比较，AngII组CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平明显升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白水平明显降低(P<0.05)；与si-con组比较，si-LINC00205组CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平明显降低(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白水平明显升高(P<0.05)。见图2，表1。

1:正常组; 2:AngII组; 3:si-con组; 4:si-LINC00205组

表 1 低表达LINC00205对HA-VSMC细胞各蛋白表达的影响

2.6高表达miR-514a-3p对HA-VSMC细胞增殖、凋亡和迁移的影响与miR-con组比较，miR-514a-3p组A值、迁移数、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平明显降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白水平明显升高(P<0.05)。见图3，表2。

1:miR-con组; 2:miR-514a-3p组

表 2 高表达miR-514a-3p对HA-VSMC细胞增殖、凋亡和迁移的影响

2.7LINC00205靶向miR-514a-3p如图4显示，Starbase预测检验后LINC00205和miR-514a-3p有结合位点。与miR-con组WT-LINC00205表达(1.00±0.12)比较，miR-514a-3p组(0.48±0.08)明显降低(P<0.05)；MUT-WT-LINC00205表达(1.02±0.19)与miR-514a-3p组(1.01±0.17)差异无统计学意义(P>0.05)。pcDNA-LINC00205组miR-514a-3p蛋白的表达(0.47±0.03)明显低于pcDNA-con组(1.01±0.10)，差异有统计学意义(P<0.05)；与si-con组miR-514a-3p的表达水平(1.02±0.09)比较，si-LINC00205组(1.75±0.21)明显升高(P<0.05)。

图 4 Starbase预测LINC00205和miR-514a-3p的结合位点

2.8低表达miR-514a-3p可以逆转LINC00205低表达对HA-VSMC增殖、凋亡及迁移的影响与anti-miR-con组比较，anti-miR-514a-3p组A值升高[(1.46±0.12)vs(1.83±0.17),P<0.05]，与si-LINC00205+anti-miR-con组比较，si-LINC00205+anti-miR-514a-3p组A值升高[(1.08±0.08)vs(1.51±0.13),P<0.05]；与anti-miR-con组比较，anti-miR-514a-3p组凋亡率降低[(4.41±0.42)vs(0.35±0.03),P<0.05]，与si-LINC00205+anti-miR-con组比较，si-LINC00205+anti-miR-514a-3p组凋亡率降低[(14.02±1.35)vs(6.51±0.63),P<0.05]。与anti-miR-con组比较，anti-miR-514a-3p组迁移数增多[(163±14)vs(213±20),P<0.05]；与si-LINC00205+anti-miR-con组比较，si-LINC00205+anti-miR-514a-3p组迁移数增多[(76±7)vs(179±16),P<0.05]。

2.9低表达miR-514a-3p可以逆转LINC00205低表达对HA-VSMCCyclinD1、Cleaved-caspase-3、caspase-3、MMP2、MMP9蛋白表达的影响与anti-miR-con组比较，anti-miR-514a-3p组CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)；与si-LINC00205+anti-miR-con组比较，si-LINC00205+anti-miR-514a-3p组CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)。见图5，表3。

1:anti-miR-con组; 2:anti-miR-514a-3p组; 3:si-LINC00205+anti-miR-con组; 4:si-LINC00205+anti-miR-514a-3p组

表 3 低表达miR-514a-3p可以逆转LINC00205低表达对HA-VSMC增殖、凋亡和迁移的影响

2.10Western blot检测NF-κB信号通路相关蛋白表达与正常组比较，AngII组p-p65、p-IкBα蛋白水平明显升高(P<0.05)；与anti-miR-con组比较，anti-miR-514a-3p组p-p65、p-IкBα蛋白水平明显升高(P<0.05)；与si-NC组比较，si-LINC00205组p-p65、p-IкBα蛋白水平明显降低(P<0.05)；与si-LINC00205+anti-miR-con组比较，si-LINC00205+anti-miR-514a-3p组p-p65、p-IкBα蛋白水平明显升高(P<0.05)。见图6，表4。

2.11Western blot检测动脉粥样硬化大鼠NF-κB信号通路相关蛋白表达与对照组比较，AS组LINC00205、p-p65、p-IкBα蛋白水平明显升高(P<0.05)，miR-514a-3p蛋白水平明显降低(P<0.05)。见表5，图7。

1:正常组; 2:AngII组; 3:anti-miR-con组; 4:anti-miR-514a-3p组; 5:si-con组; 6:si-LINC00205组; 7:si-LINC00205+anti-miR-con组; 8:si-LINC00205+anti-miR-514a-3p组

表 4 NF-κB信号通路相关蛋白表达

表 5 动脉粥样硬化大鼠NF-κB信号通路相关蛋白表达

1:对照组; 2:AS组

3 讨 论

研究表明，在AS患者发病及恶化过程中，LncRNA起重要介导作用[9-10]，典型例子为LncRNA 430945能够有效介导AS患者血管平滑肌细胞的繁殖与迁移[11]。LncRNA LEF1-AS1通过靶向miR-544a/PTEN轴而调节血管平滑肌细胞的迁移和增殖[12]。LncRNA MEG8通过靶向PPARα调节血管平滑肌细胞的增殖、迁移和凋亡[13]。但LINC00205在动脉粥样硬化发生过程中的作用机制尚未阐明。

本研究结果显示，AngII诱导的HA-VSMC细胞中LINC00205的表达水平升高，关于LINC00205在动脉粥样硬化中的表达及其可能作用机等尚未见报道。已有研究表明LINC00205在肝细胞癌、肺癌、视网膜母细胞瘤等肿瘤中表达水平升高，并可促进肿瘤的发生及发展[14-16]。表明LINC00205在动脉粥样硬化发生过程中可能发挥重要调控作用。本研究进一步研究显示AngII诱导的HA-VSMC细胞增殖能力及迁移能力明显增强，而细胞凋亡率明显降低，并可促进CyclinD1、MMP2、MMP9表达及抑制Cleaved-caspase-3表达，这结果与相关文献报道相似[17-19]，提示成功建立动脉粥样硬化模型。体外细胞实验中采用AngII诱导HA-VSMC细胞，抑制LINC00205表达后可明显降低细胞增殖及迁移能力，并可提高细胞凋亡率，提示抑制LINC00205表达可抑制AngII诱导的HA-VSMC细胞增殖及迁移，并可诱导细胞凋亡。

本研究证实LINC00205可充当miR-514a-3p的竞争性内源RNA。miR-514a-3p在肾细胞癌中起着抑癌作用[20]。在本研究中，miR-514a-3p蛋白在AngII介导的HA-VSMC细胞中呈明显的低表达趋势，而深入研究结果表明miR-514a-3p过表达可明显降低AngII诱导的HA-VSMC细胞活力及减少迁移细胞数，并可促进细胞凋亡，而抑制miR-514a-3p表达可明显逆转上述作用，提示miR-514a-3p过表达可抑制AngII诱导的HA-VSMC细胞增殖及迁移，并可诱导细胞凋亡。另外，本研究中还发现同时降低LINC00205蛋白和miR-514a-3p蛋白表达，不仅能够大大提高AngII介导的HA-VSMC细胞的繁殖和迁徙能力，还能够大大提高细胞总成活率，提示抑制miR-514a-3p表达可明显逆转抑制LINC00205表达对AngII诱导的HA-VSMC细胞增殖、凋亡及迁移的作用。金雀异黄素通过抑制ER-p38/ERK1/2-PPARγ-NF-κB信号通路而抑制大鼠血管平滑肌细胞迁移[21]。p-p65、p-IкBα是NF-κB信号通路的主要蛋白，通过抑制NF-κB信号通路的活化可明显抑制AngII诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移[22]。本研究结果显示，AngII诱导的HA-VSMC细胞中p-p65、p-IкBα的表达水平升高，而抑制LINC00205表达后可明显降低p-p65、p-IкBα的表达水平，抑制miR-514a-3p表达可明显逆转抑制LINC00205表达对NF-κB信号通路的作用，提示抑制LINC00205表达可通过调控miR-514a-3p/NF-κB通路而发挥作用，动脉粥样硬化大鼠的在体研究也证实了上述细胞学研究结论。

另外，从信号通道层面，参与动脉粥样硬化还包括酪氨酸蛋白激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)，两者均与脂质沉积和炎性浸润的调控相关。长链非编码RNA与上述信号通道在动脉粥样硬化或代谢性疾病的发生发展也有相关报道，如Yao等[23]报道Lnc00113 通过激活 PI3K/Akt 信号通路促进细胞增殖、存活和迁移，可作为动脉粥样硬化的潜在治疗靶点。Han等[24]研究认为LncRNA H19 通过调节 JAK/STAT 通路促进海马神经胶质细胞活化，并可能成为预防癫痫的治疗手段。那么是否存在LINC00205与上述经典动脉粥样硬化信号通道存在调节关系，仍有必要进一步研究探讨。

综上所述，在AngII诱导的HA-VSMC细胞中，LINC00205蛋白高表达，miR-514a-3p蛋白则低表达，降低LINC00205蛋白的表达，会经增加miR-514a-3p蛋白表达而抑制AngII诱导的HA-VSMC细胞增殖及迁移，同时增加细胞凋亡率，NF-κB信号通路活性下降是导致该情况的主要原因，这可以作为早期诊断AS的靶向指标，对后续从分子层面分析AS患者发病机制的研究具有重要指导意义。