微型染色质维持蛋白家族在人类食管癌发生发展中的影响

王 利，刘丹薇

0 引 言

食管癌是一种常见的恶性肿瘤，其起源于食管黏膜上皮细胞，在全球癌症相关死亡人数中居于第6位[1]。这一恶性肿瘤主要分为两种组织学类型：食管鳞状细胞癌(简称鳞癌)和食管腺癌[2]。尽管近年来在食管癌的诊断和治疗方法上取得了一定的进展，我国的食管癌生存率依旧很低。因此，明确预后标志物和潜在的药物靶点可以为食管癌的早期诊断和治疗提供可靠依据[3-4]。

细胞不受控的增殖的前提条件之一是DNA复制过程异常改变，目前真核细胞复制因子靶向治疗肿瘤的方案已在临床上得到了广泛的应用[5]。针对拓扑异构酶、DNA合成酶，核糖核苷酸还原酶及端粒酶等靶点的小分子抑制剂已被开发应用于癌症治疗[6]。尽管这些小分子的抑制剂已被证实是具有疗效的抗肿瘤药物，但这些化合物可同时抑制正常和异常的DNA复制过程因而副作用明显[7]。然而，很少有针对DNA复制起点的抑制剂被开发应用于癌症治疗。微型染色体维持蛋白(minichromosome maintenance proteins，MCMs)最初被发现在复制起始过程中具有解螺旋酶的活性，在细胞周期内控制复制起始时间发挥重要作用[8]。MCMs家族是DNA复制与细胞周期进程和检查点调控结合的一个重要因素，为药物开发提供了一个独特而有趣的替代靶点[9]。目前关于食管癌组织中MCMs家族成员的表达情况及作用机制尚不明确。本研究应用生物信息学的方法探究MCMs家族在食管癌患者中的表达情况并探究其在食管癌发生发展过程中的作用，以期为食管癌提供有价值的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 MCM家族在食管癌中的表达情况分析Oncomine数据库(https://www.oncomine.org/resource/login.html)整合多种来源如GEO、TCGA和已发表的多种基因的RNA及DNA-seq数据。GEPIA基因表达谱动态分析数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)是基于TCGA和GTEx数据库中相关癌症中的表达情况并转换成可视化点线图和箱型图模型的可视化在线分析数据库。我们应用以上两个数据库分析MCMs家族各个成员在食管癌患者中相较于正常食管黏膜上皮细胞的mRNA表达情况。同时应用GEPIA数据库分析了MCM家族基因表达情况与食管癌临床病理分期的相关性。此外，还分析了MCM家族各个成员之间在食管癌组织中的共表达现象。人类蛋白质图谱(https://www.Protein Atlas.org)包含44种来自免疫组织化学染色的正常人类组织蛋白表达数据。蛋白数据涵盖了15 313个基因，同时还注明了免疫组化的抗体名称，可用于发现基因的蛋白表达情况。我们应用人类蛋白图谱分析了MCM家族蛋白在正常食管黏膜上皮细胞的表达情况。

1.2基因表达预后数据库分析Kaplan-Meier plotter数据库(http://kmplot.com/analysis)能够分析超过50 000个样本的基因微阵列、RNA测序和二代测序结果，评估目的基因对各种类型肿瘤生存率的影响。应用Kaplan-Meier plotter工具在线分析MCMs家族mRNA表达的中位数并将食管癌患者分为低表达组和高表达组。通过K-M生存曲线分析MCMs表达对食管癌患者的预后价值。

1.3MCM家族基因的突变情况及在食管癌患者中MCMs家族的共表达基因cBioPortal(http://www.cbioportal.org/)是用于探索并分析可视化的多维癌症基因的数据库，在本研究中分析了6个MCMs家族成员的基因的突变情况及突变类型。同时应用该网站找到与50个与MCMs家族成员具有共表达现象的基因并应用String蛋白互作分析网站绘制成蛋白相互作用网络图。

1.4MCMs家族成员及其共表达基因的GO、KEGG信号通路的富集分析应用DAVID(基因功能注释在线网络工具)数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对我们所找到的与MCMs家族成员具有共表达现象的关键基因进行细胞组成，分子功能和生物过程等几个方面进行基因本体功能注释。最后，同样应用该在线软件进行KEGG信号通路的富集分析。

2 结 果

2.1 Oncomine数据库中MCMs家族成员在食管癌中的转录水平分析Oncomine数据库的结果显示MCM2在2个食管癌数据集中表达增高，见表1，图1。在Su和Hu数据集的食管鳞状细胞癌子集中表达增高，增高的倍数分别为2.717，4.186。MCM3在Hu的数据集的食管鳞状细胞癌数据子集中表达增高，增高倍数为2.159。MCM4在Hu和Su数据集的食管鳞癌数据子集中表达增高，增高倍数为2.292，2.554。MCM5在Su和Hu数据集的食管鳞癌子集中表达增高，增高倍数分别为2.354，2.419。MCM6在Wang数据集的食管腺癌子集中表达增高，增高倍数为2.248；在Hu数据集的食管鳞癌子集中表达增高，增高倍数为2.725。MCM7在Su数据集的食管鳞癌子集中表达增高，增高倍数为2.004。

2.2GEPIA数据库中MCMs家族成员在食管癌中的mRNA表达水平及其家族各个成员间的共表达情况应用GEPIA在线网站，分析了MCMs家族基因在食管癌及正常食管组织中的mRNA表达情况。基因表达点状图和箱型图结果均显示MCM2～6在食管癌患者中均呈现表达增高的现象，MCM7虽高表达与食管癌组织中但差别无统计学意义(P>0.05)，见图2。MCMs家族成员在食管癌中的共表达情况分析表明MCMs各家族成员的表达在食管癌组织中具有相关性(P<0.05，R>0.4)，见图3。

表 1 MCMs家族基因在不同类型食管癌较正常食管组织的转录水平差异(Oncomine数据库)

红色代表高表达，蓝色代表低表达

a:MCMs在食管癌中表达的散点图；b:MCMs在食管癌中表达的箱形图

图 3 MCMs家族成员在正常食管组织中的蛋白表达情况

2.3人类蛋白图谱数据库中MCMs家族在正常食管组织中的免疫组化分析由于人类蛋白图谱网站不包含食管癌患者的免疫组化蛋白表达分析，因此只展示正常食管组织的MCM2～7表达图。MCM2～7蛋白在正常的食管组织中呈现低表达和中等表达的模式，蛋白质表达评分基于人工对染色强度(阴性，弱，中度或强度)和染色细胞比例(<25%，25～75%或>75%)进行评分的免疫组织化学数据。强度和分数的每种组合会自动转换为蛋白质表达水平评分，MCM2～7的蛋白表达据网站评分分析只有低表达和中等表达两种方式，见图3。

2.4MCMs家族成员mRNA表达情况与食管癌患者预后的关系在食管鳞状细胞癌患者中，MCM4，MCM6的高表达与食管鳞癌患者的总生存率(OS)高度相关(logrankP=0.002, 0.01)；在食管腺癌患者中，MCM4, MCM6的低表达与食管腺癌患者的OS高度相关(logrankP=0.0016, 0.048)。该家族其他因子与食管癌患者的总生存率相关性不大。见图4。

图 4 MCMs家族成员mRNA水平与食管癌患者预后的关系

2.5MCMs家族成员在食管癌患者中的突变情况及共表达基因使用cBioPortal在线工具分析了MCMs家族基因的突变情况及其与相邻基因相互作用网络。49例食管癌患者中的13例(27%)发生MCMs的改变。该家族成员在食管腺癌患者中，19.32%的患者发生了扩增, 4.55%的患者发生了突变，3.41%的患者发生了多重基因改变。该家族成员在食管鳞状细胞癌患者中，21.88%的患者发生了扩增，3.13%的患者发生了突变。然后找到MCMs家族具有共表达现象的50个基因。结果表明，细胞周期相关基因以及DNA复制相关基因与MCMs的改变密切相关。通过基因本体(GO)和京都基因与基因百科全书(KEGG)在DAVID预测了MCMs家族基因和与MCMs 改变显著相关的基因的功能。基因本体分析从生物学过程，细胞成分和分子功能3个方面预测MCMs家族及其MCMs家族突变相关目标基因的功能作用。结果显示，从生物学过程方面，MCMs的改变显著调控食管癌中DNA复制起始过程。从细胞成分角度，MCMs的改变显著调控核染色体端粒区的组成，MCMs复合体的组成，细胞核质的组成以及核起源的复制识别复合体的组成。从分子功能角度，MCMs的改变显著调控DNA复制源结合，DNA定向DNA聚合酶活性，3'-5'核酸外切酶活性。在KEGG分析中，DNA复制，细胞周期，错配修复，核酸切除修复在内的4条途径与食管癌中MCMs突变的功能相关，见图5。

a:M生物学角度；b:细胞成分角度；c:分子功能角度；d:KEGG分析

3 讨 论

在以往的研究中，MCMs家族是由在所有真核生物中高度保守的6个相关蛋白组成，他们包括MCM2、MCM3、MCM4、MCM5和MCM6[10]。许多研究阐明了MCMs家族基因在转录调控、染色质重塑以及检测点反应等基因稳定性等多个方面发挥重要作用[11-12]。近年来，MCMs家族已被报道是宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌和胶质瘤等一系列人类肿瘤的预后标志物[13-15]，但是MCMs在食管癌的发生和预后中的作用仍不清楚。我们的研究首次报道了MCMs家族成员MCM4和MCM6在人类食管癌中的高表达与食管腺癌的预后相关；同时发现了该家族成员之间在食管癌中的共表达现象。通过与MCMs突变显著相关基因的基因富集分析，确定了MCMs家族在生物过程，细胞成分和分子功能这3个方面的作用。总之，我们的研究表明MCM4和MCM6可能是食管癌患者的一个独立预后因素，有待进一步的验证性研究。

在MCMs家族的众多因子中，MCM2被报道与MCM5、Ki-67一起在食管鳞状上皮和Barrett's黏膜中持续高表达，这种表达模式可能是诊断食管鳞状上皮异常增生的标志并提示细胞周期调控和分化的中断[16]。一项关于食管鳞状细胞癌芯片的差异表达分析，通过进一步的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析得出MCM2为PPI网络分析的中枢基因[17]。Kato对93例食管鳞癌手术切除组织的MCM2，Ki-67表达情况与患者的病理分期和预后情况进行分析，发现MCM2比Ki-67对于评估食管鳞癌患者的肿瘤生长侵袭以及预后价值方面具有更可靠的临床价值[18]。在我们的研究中，ONCOMINE数据库和GEPIA数据库都显示MCM2基因与正常食管组织相比在食管癌组织中表达明显增高。此外，MCM2与该家族的其他成员基因在食管癌组织中的都存在一个共表达的现象。

目前的研究尚未发现MCM3与食管癌具有相关性，但该基因与人类其他癌症的相关性已有广泛报道[19]。MCM3是一种新型的口腔鳞状细胞癌增殖的标记物，同时MCM2和MCM3一同通过DHX9促进骨肉瘤的进展并可预测患者的不良预后[20-21]。我们的研究发现，ONCOMINE和GEPIA数据库的结果都显示MCM3与正常组织相比在食管癌组织中表达增高。惊喜的是MCM3也同样与该家族的其他成员在食管癌组织中存在一个共表达的现象。

Choy等[22]的研究发现，在食管癌和癌前病变中MCM4和MCM7的表达与Ki-67、Bmi1和cyclin E的表达显著相关，可以作为较为敏感的食管病变相关增殖标志物。一项关于中国南方食管癌中MCM4表达情况的研究表明MCM4可能与食管癌的病理分期有关，MCM4的改变可能与早期食管癌的发生密切相关，是一个食管癌发生发展的潜在分子标记物[23]。我们检索了ONCOMINE和GEPIA数据库发现MCM4在食管癌组织中也呈现高表达的模式，并且这种高表达与食管鳞癌的不良预后高度相关。此外，MCM4与该家族的其他成员在食管癌组织中都呈现一个共表达的现象。

Everson等[24]将61名患者分为正常，非增生性Barrett's食管，高度增生性Barrett's食管和食管腺癌并检测患者胃液中的MCM5表达量，惊喜地发现MCM5的平均表达量随疾病的进展而增加，该因子可能为Barrett食管相关瘤变标志物[24]。MCM5也与MCM2一起参与食管鳞状上皮的异常增生。ONCOMINE和GEPIA数据库的结果共同表明MCM5在食管癌组织中对比正常组织呈现一种高表达模式。此外，MCM5与该家族的其他因子一起在食管癌组织中存在一个共表达的现象。

MCM7被发现可以通过激活AKT1/mTOR信号通路促进食管鳞状细胞癌的增殖和迁移，其与MCM4一同被认为是潜在的食管癌增殖的新型标志物[25]。也有研究表明在食管鳞状细胞癌中，MCM7与G9a的表达情况与食管癌的预后不良高度相关[26]。我们的研究发现ONCOMINE数据库中MCM7在食管癌组织中也同样存在一个高表达现象。

在本研究中，我们系统的分析了MCMs在食管癌中的表达和预后价值，MCMs家族基因在食管癌患者中都呈现相同的高表达现象，同时MCM4和MCM6在食管鳞癌患者中的高表达现象与食管癌患者的OS高度相关，MCMs家族的因子在食管癌中的表达增加可能在食管癌的发生中起重要作用。值得注意的是，我们发现在食管鳞状细胞癌患者中，高表达的 MCM4，MCM6与食管鳞癌患者的OS高度相关；而在食管腺癌患者中，低表达的 MCM4，MCM6与食管腺癌患者的 OS 高度相关。这可能是由于在临床上，食管腺癌的发病率远低于食管鳞癌，这对于发病率较低的食管腺癌进行判断生存预后可能存在偏差。此外，因为癌症类型不同，同一基因的表达对预后的影响也会有差异，所以MCMs家族基因表达对预后的影响还需要更多临床样本收集和验证。通过对MCMs家族基因的相邻基因互作分析，结果表明MCMs家族基因的改变与细胞周期及DNA复制相关基因密切相关。通过GO分析和KEGG分析我们发现该家族基因与从参与生物学过程角度与DNA复制过程相关，从细胞成分的角度其参与MCMs复合体的形成，从分子功能角度其参与DNA复制起始位点的功能。KEGG分析发现该家族基因参与DNA复制，细胞周期等四条途径。MCMs家族成员的突变率也很高(27%)，这些结果表明MCMs可能是食管癌患者生存的预后标志物。