巨噬细胞极化失衡与类风湿关节炎疾病活动及骨侵蚀的相关性

王东轶，沈俊逸，陆 乐，蔡 辉

0 引 言

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是多关节对称性累及的多种免疫细胞参与的慢性炎症性疾病，严重者可致残，影响患者生活质量且造成社会经济负担。滑膜巨噬细胞(synovial macrophages，SMs)是参与RA滑膜炎症和骨侵蚀的重要免疫细胞。在RA患者的血液和滑膜液中存在极化不平衡的现象，其中滑膜液中的巨噬细胞失衡更为明显[1]。鉴于不同组织体液中巨噬细胞极化情况可能存在差异，进一步深入研究RA患者滑膜组织中巨噬细胞极化的情况尤为必要；但目前相关研究鲜有报道。本研究运用免疫荧光染色，回顾性分析关节置换或滑膜切除术的RA、膝骨关节炎(osteoarthritis，OA)和创伤性骨关节炎(post-traumatic osteoarthritis，PTOA)患者的SMs表面标志物CD86、iNOS和CD206的表达特点，并进一步分析巨噬细胞表型和RA疾病活动以及骨侵蚀的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象回顾性分析2016年1月1日至2020年12月31日东部战区总医院收治RA、OA和PTOA患者临床资料。RA诊断标准采用2010年美国风湿病学会和欧洲抗风湿病联盟共同发布的类风湿关节炎分类标准[2]；OA和PTOA诊断标准参考2018年中华医学会骨科学分会更新的骨关节炎诊疗指，其中PTOA具有外伤或其他手术病史。

1.2组织标本免疫荧光染色石蜡切片置于65 ℃烘箱中烘烤1 h，脱蜡至水后置于EDTA抗原修复液中高压修复。再将切片入3%过氧化氢溶液，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶。滴加二抗相同宿主的血清，封闭30 min。在切片上滴加一抗，4 ℃湿盒内过夜孵育。再滴加二抗，室温30 min(避光孵育)。在切片上滴加DAPI，染核10 min。

1.3观察指标应用免疫荧光染色处理各组患者滑膜组织后，利用荧光显微镜(Nikon，Ts2R)摄片并使用image J软件自动定量分析CD68+iNOS+SMs和CD68+CD206+SMs的数量，计算CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs比值。收集RA患者的实验室指标，包括类风湿因子(rheumatoid factor，RF)、抗环瓜氨酸多肽抗体(anti-cyclic citrullinated peptide antibody，anti-CCP)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)。根据关节压痛数、关节肿胀数和ESR计算改良疾病活动性标准(disease activity score in 28 joints，DAS28)(3变量)评分。

1.4影像学指标采用Larsen诊断分级(0～5级)评估RA患者骨侵蚀的情况：0级=正常；1级=轻微改变，软组织肿胀、关节骨质疏松、关节狭窄；2级=决定性改变，一个或多个小侵蚀；3级=显著变化，明显侵蚀；4级=严重变化，较大侵蚀，仅保留部分原始关节面；5级=残缺性改变，原始关节面已消失，可能出现严重畸形[3-4]。

2 结 果

2.1 一般资料共收集病例189例。其中RA患者95例，年龄28～81岁，平均(56.93±11.72)岁，男10例、女85例；OA患者76例，年龄49～86，平均(67.14±8.62)岁，男16例、女60例；PTOA患者18例，年龄26～61岁，平均(47.56±8.88)岁，男11例、女7例。3组患者年龄、性别差异有统计学意义(P<0.05)。根据DAS28-3评分对95例RA患者进行分组：评分≥2.6 分为RA活动组，共74例，其中男7例、女67例，平均(58.15±10.38)岁；评分<2.6 分为RA缓解组，共21例，其中男3例、女18例，平均(52.62±15.08)岁。

2.2RA组、OA组和PTOA组巨噬细胞表型的比较CD68+iNOS+SMs、CD68+CD206+SMs和CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs在3组中差异均有统计学意义(P<0.01)。进一步采用Nemenyi检验进行两两比较，结果RA组中的CD68+iNOS+SMs和CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs明显高于OA组和PTOA组；CD68+CD206+SMs则反之(P<0.01)。见图1，表1。

RA：类风湿关节炎；OA：膝骨关节炎；PTOA：创伤性骨关节炎；SMs：滑膜巨噬细胞；*表示P<0.01

表 1 RA、OA和PTOA的巨噬细胞表型

2.3RA活动组与缓解组巨噬细胞表型比较RA活动组中CD68+iNOS+SMs和CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs明显高于RA缓解组，CD68+CD206+SMs则反之，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表 2 RA活动组和缓解组的观察指标

2.4巨噬细胞表型与RA疾病活动指标及DAS28-3评分的相关性CD68+iNOS+SMs和CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs皆与RA疾病活动指标及DAS28-3评分呈正相关，CD68+CD206+SMs则呈负相关(P<0.01)。见表3。

表 3 巨噬细胞表型与RA活动性指标及DAS28-3评分的相关性[r(P)]

2.5巨噬细胞表型与Larsen诊断分级的相关性CD68+iNOS+SMs和CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs与其呈正相关，CD68+CD206+SMs反之，且具有显著性统计学意义(P<0.01)。见图2。

图 2 巨噬细胞表型与Larsen诊断分级的相关性

2.6巨噬细胞表型对RA疾病诊断价值巨噬细胞表型对RA疾病诊断效能3项指标对RA的诊断均具有一定意义，(AUC>0.5，P<0.01)。其中CD68+CD206+SMs的敏感度更高，而CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs比值的特异度和总体诊断价值更高。见图3，表4。

图 3 巨噬细胞表型诊断RA的ROC曲线

表 4 巨噬细胞表型的疾病诊断评价

巨噬细胞表型对RA疾病活动度诊断效能3项指标对RA疾病活动度的诊断均具有一定意义(AUC>0.5，P<0.01)。其中CD68+CD206+SMs的敏感度、特异度和总体诊断效能更高，见图4，表5。

图 4 巨噬细胞表型诊断RA活动度的ROC曲线

表 5 巨噬细胞表型的疾病活动度诊断评价

3 讨 论

SMs是构成RA滑膜组织的重要细胞。它主要来源于常驻组织的巨噬细胞和循环中的单核细胞，但其确切的起源和功能尚未完全清楚[5]。SMs数量增加是RA病情活动的早期标志和炎症维持的重要特征，但事实上SMs在关节炎症发生和发展过程的作用具有异质性，不同的巨噬细胞在体内稳态和炎症过程中的功能各异，如CX3CR1+衬里巨噬细胞通过紧密连接形成免疫屏障，可隔离关节和控制炎症，一旦屏障紊乱，循环单核细胞来源的促炎巨噬细胞内流，并产生白介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等促炎细胞因子，加重关节炎症[6-7]。

组织微环境和细胞因子的刺激可诱导SMs表型和功能的改变。90年代早期，研究者们发现巨噬细胞在不同细胞因子刺激下极化的两种表型，M1型巨噬细胞表面表达CD80、CD86、CD282、主要组织相容性复合体II类分子和iNOS等，向T细胞呈递抗原，产生TNF-α、IL-1β、IL-6以及活性氧和一氧化氮，发挥致炎作用；M2型巨噬细胞表面表达CD163、CD206和CD200R，分泌IL-10、转化生长因子和血管内皮生长因子等，发挥抗炎作用并修复受损组织。随后的研究进一步发现巨噬细胞极化呈动态连续性，即在多因素影响下这2种极端表型之间存在连续的中间表型[8]。但M1和M2表型仍是2种极端状态的典型表型，且在微环境发生改变时巨噬细胞极化具有可逆性[9]。因此通过调节巨噬细胞极化来改善RA滑膜炎症，有望成为新的免疫治疗目标。

已有诸多研究表明在RA患者或动物模型的外周血液和关节腔积液中存在巨噬细胞极化不平衡的现象[10-12]；但不同体液或组织中的巨噬细胞极化情况可能存在差异，且目前针对RA患者滑膜组织中SMs表型的研究较少。本研究回顾性分析了RA、OA和PTOA患者的滑膜组织中SMs表型的特点，结果显示RA患者的滑膜组织中CD68+iNOS+SMs数目居多，且CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs比值明显高于OA和PTOA患者，这与既往研究所报道的RA患者关节腔积液中巨噬细胞极化情况大致相同[1]。此外，RA活动组中的CD68+iNOS+SMs和CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs也显著高于RA缓解组，CD68+CD206+SMs则反之。iNOS和CD206分别是M1表型和M2表型巨噬细胞的表面标记物，RA疾病活动期的患者滑膜组织中数目增多的CD68+iNOS+SMs可能产生了促炎细胞因子和趋化因子，进而促进滑膜炎症和骨破坏，而CD68+CD206+SMs水平增高则有利于抗炎和组织修复。

不可逆的骨侵蚀也是RA的特征性表现，而Larsen诊断分级是一种通过X片评估RA骨侵蚀的经典方法[4]。本研究中CD68+iNOS+SMs与Larsen诊断分级呈正相关，而CD68+CD206+SMs则呈负相关，说明这两种巨噬细胞表型与骨侵蚀密切相关，这也可能与炎症本身会抑制骨形成和促进骨吸收有关[13]。相关研究证实了炎性细胞因子如中性粒细胞、肿瘤坏死因子-α、IL-6和IL-1等可刺激破骨细胞生成，抑制成骨细胞介导的骨质形成和修复，最终导致骨侵蚀[14, 15]，其中TNF-α可以直接诱导巨噬细胞分化为破骨细胞参与骨破坏。

根据相关实验研究显示，RA患者血清和关节炎积液中的巨噬细胞极化情况与疾病活动度相关[16]。Alivernini等[9]分析了治疗初期活动性RA、耐药活动性RA、疾病缓解RA和健康志愿者的SMs亚群，发现MerTKposCD206posSMs与疾病活动呈负相关，在病情缓解者的滑膜组织中比例更高，可驱动调节性T细胞分化并抑制效应T细胞活性。本实验也证实了CD68+CD206+SMs数目与RF、anti-CCP、CRP、ESR等RA疾病活动指标以及DAS28-3评分呈负相关，此外，我们还发现CD68+iNOS+SMs数目和CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs比值与RA疾病活动指标以及DAS28-3评分呈正相关，其中CD68+iNOS+SMs数目对RA疾病活动度的诊断价值更高，有望成为评估病情活动情况和治疗效果的新指标。

综上所述，RA患者滑膜组织中CD68+iNOS+SMs明显高于OA和PTOA患者，参与RA的滑膜炎症和骨侵蚀，并与RA疾病活动呈正相关，CD68+CD206+SMs则反之。此外，CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs比值和CD68+iNOS+SMs数目分别在RA疾病诊断和活动度诊断方面具有较高效能。鉴于巨噬细胞极化与RA疾病活动的密切相关性，期待更多实验研究进一步探索巨噬细胞在RA发病机制中的具体作用，为靶向性治疗RA提供新思路。