Annexin 5对大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌过程中StarD7表达的影响

靖 俊，林钗英，伊 男，伏海燕，姚 兵

0 引 言

膜联蛋白(annexins)是真核生物中广泛存在的一类的钙依赖性磷脂结合蛋白，膜联蛋白5(annexin 5)是annexins家族中分布最广泛、含量最丰富的成员之一，约占细胞总蛋白的1%，其相对分子质量约36000［1］，参与很多重要的生理功能，如抗凝血［2］、钙离子通道活性［3］、具有抑制磷脂酶A2以及蛋白激酶 C 的活性［4］等。Kawaminami等［5］研究发现 annexin 5呈细胞特异性分布于大鼠甲状腺、肾上腺、卵巢、睾丸等内分泌器官。前期的研究发现重组annexin 5以时间和剂量依赖性的方式直接影响大鼠睾丸间质细胞中睾酮分泌［6］，提出了annexin 5可能是一种重要的生殖内分泌调控因子。

StarD7是类固醇激素合成急性调节蛋白相关脂类转运结构域(steroidogehic acute regulatory proteinrelated lipid transfer domain，START)蛋白家族成员之一，编码295个氨基酸残基，相对分子质量为34700的新型蛋白质，其生物学功能至今未明。通过生物信息学分析，发现其全长序列中含有一个类固醇敏感性调节蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein，StAR)相关脂类转运体结构域(START)。START蛋白参与调节多种生理功能，主要涉及脂类结合介导的细胞信号转导、脂类转运和调节以及脂类代谢信号通路。前期二维电泳结合质谱分析发现StarD7在1 nmol/Lannexin 5刺激睾丸间质细胞24 h后表达显著增加［7］，提示StarD7可能是annexin 5刺激睾丸间质细胞合成睾酮过程中的关键蛋白。本实验室拟从转录与翻译水平上观察重组大鼠annexin 5蛋白对离体培养的成年SD大鼠睾丸间质细胞中StarD7的表达变化情况，并获得StarD7在睾丸间质细胞中的定位信息，为研究StarD7在annexin 5影响睾丸间质细胞睾酮合成过程中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料及仪器 清洁级SD雄性大鼠，体重220～250g左右，3～4月龄，由南京军区南京总医院比较医学科提供，使用许可证号:SYXK(军)2007－029。动物实验房实验前清洁、消毒。温度(22±2)℃，光控为07:～19:00光照，19:00～次日07:00黑暗。annexin 5由本实验室合成，保存于pH8.0 Tris-HCl中(终浓度 0.15 mg/ml);DMEM/F12 培养基购自GIBCO公司;胶原酶Ⅰ型购自Sigma公司;小牛血清购自杭州四季青公司;Percoll分离液进口分装购自Amersham Pharmacia Biotech;细胞裂解液购自碧云天生物技术研究所;StarD7抗体购自ProteinTech Group;DAB显色液购自福建迈新公司;小鼠抗大鼠β-actin、羊抗小鼠IgG-HRP和羊抗兔IgGHRP购自武汉博士德公司;TRIZOL试剂购自Invitrogen公司;反转录试剂盒购自Fermentas公司;即用型Taq酶PCR试剂盒购自上海GeneRay Biotech公司;引物由上海英骏生物公司合成;其他化学试剂均为国产分析纯。TH4-200倒置显微镜购自日本Olympus;LXJ-Ⅱ型离心沉淀机购自上海医用分析仪器厂;200目筛网购自南京新卡托仪器设备有限公司，细胞培养箱购自上海新苗医疗器械公司，Z-323K型高速冷冻离心机购自德国Hermle公司，垂直电泳仪购自Tanon生物技术公司，TY-80S型脱色摇床购自南京大学生物技术公司，PVDF膜购自Millipore公司，细胞培养板为Corning公司产品，普通PCR仪为Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠睾丸间质细胞的分离、纯化与原代培养雄性SD大鼠麻醉后断颈处死，75%乙醇消毒，腹腔剖开取出睾丸，转移至加入少许PBS(0.01 mol/L，PH 7.4)的无菌培养皿中;去除睾丸被膜、脂肪和血管等组织，清洗数次后将睾丸转移到含有4 mlⅠ型胶原酶(0.5 mg/ml)离心管中，34℃，250 r/min 摇床消化30min后(离心半径3cm)，加入4ml的含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，静置后取上清。上清液经200目筛网过滤(2次)，滤液转移到离心管中，1000r/min离心5 min(离心半径3 cm)，弃上清，再用DMEM/F12培养液重新悬浮细胞，1000 r/min离心5 min(离心半径3 cm)，弃去上清，后加入含10%小牛血清的DMEM/F12培养液，制成细胞悬液。加到提前配置的Percoll密度梯度［8］离心液上，3000 r/min密度梯度离心20 min(离心半径12 cm)，呈现4层，第3层为睾丸间质细胞，吸出后加入部分DMEM/F12培养液，离心去除Percoll液，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，调整细胞密度至106个/ml接种于6孔板中，每孔1.5～2 ml，置于34℃、CO2培养箱中进行培养。并利用细胞爬片实验来验证分离纯化的睾丸间质细胞的纯度。

1.2.2 细胞加药与化学发光法测定睾酮 细胞培养24h后弃去旧的培养基，加药组加入含终浓度为10－9mol/L的annexin 5蛋白溶液(溶于pH8.0的Tris-HCl溶液中)，对照组加入含等体积pH8.0的Tris-HCl溶液，34℃孵育24 h。按仪器和试剂盒说明书所述，采用化学发光法测定细胞培养上清中睾酮含量。

1.2.3 细胞总RNA的提取 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次后，每孔中加入800 μl TRIzol总RNA提取试剂，4℃、12000 r/min离心15 min(离心半径5cm)。取上清置另一EP管中，加入160 μl氯仿，剧烈震荡混匀，室温放置5 min。4℃、12000 r/min离心15min(离心半径5cm)，取水相，加0.5 ml异丙醇，室温放置10min。4℃、12000r/min离心10min(离心半径5cm)，弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤沉淀，4℃、12000r/min离心5min(离心半径5 cm)。弃上清，沉淀在室温下干燥5 min，用适量的DEPC水溶解RNA沉淀，用分光光度计测其浓度及纯度。另取5μl RNA溶液用1%琼脂糖电泳，观察RNA的完整性。

1.2.4 细胞总蛋白提取 将6孔板中的培养液弃去，加入预冷的PBS漂洗2次后，每孔加入200 μl的细胞裂解液(含有终浓度为1 mmol/L的PMSF)，作用2～3 min后用细胞刮刀将细胞刮离板壁，使贴壁的细胞裂解下来。将细胞悬液移入EP管中，在4℃条件下，12000r/min离心5min(离心半径5cm)，取上清即为睾丸间质细胞的总蛋白溶液。

1.2.5 反转录 使用Fermentas第一链cDNA合成试剂盒按照操作说明进行反转录反应。反应体系为:5 × Reaction Buffer 4.0 μl、10 mmol/L dNTP 2 μl、Olig(dT)18引物 1.0 μl、RNA 酶抑制剂 1 μl、反转录酶 1 μl(200U/μl)，RNA 模板 1 μg，加无核酶水至20 μl。42℃反应 60 min，70℃5 min灭活，产物于－20℃保存待用。

1.2.6 聚合酶链式反应 在Genbank上查找大鼠StarD7、内参Rpl19的mRNA序列，取其保守区，使用primer premier 5.0设计引物。由上海英俊生物技术有限公司合成，引物序列及其反应条件见表1。反应体系为:2×Taq酶 PCR反应混合液12.5 μl、ddH2O 9.5μl、引物1(20μmol/L)1μl、引物2(20μmol/L)1 μl、cDNA 模板 1.0 μl。反应条件为:94 ℃ 预变性5 min，94℃变性时间 30 s，退火时间 30 s，72℃延伸时间40～60 s，35个循环，具体见表1。

表1 聚合酶链式反应引物序列及反应条件Table 1 Primer sequences and reaction conditions of polymerase chain reaction

1.2.7 电泳及观察分析 PCR产物经1%琼脂糖凝胶上电泳分离后，采用凝胶电泳成像分析系统观察、拍照。用Quantity One分析StarD7片段和内参基因Rpl19的灰度，以目的片段的灰度/Rpl19灰度反应StarD7基因的相对表达量。

1.2.8 Western blotting 分析 将细胞总蛋白用6×上样缓冲液稀释后，沸水浴煮沸5 min，每孔上样量30μl，12%SDS-PAGE 分离，恒压70 V 转移3.5 h，全湿法电转移至PVDF膜上。50 g/L脱脂奶粉37℃封闭1.5h，TBST洗膜3次，每次5 min;分别加兔抗大鼠StarD7抗体(1∶200稀释)、小鼠抗大鼠β-actin抗体(1∶300稀释)4℃孵育过夜。次日，封闭液洗膜3次，每次5 min;TBST洗膜3次，每次5 min。加HRP标记的羊抗兔IgG(1∶800稀释)、羊抗小鼠IgG(1∶700稀释)室温温育1 h。封闭液洗膜3次，每次5 min;TBST洗膜5 min，各3次，DAB显色。实验结果拍照并用quantity-one软件分析每个条带的灰度值，以StarD7条带与β-actin条带的灰度值的比值分别表示StarD7蛋白的相对含量。

1.2.9 免疫细胞化学 将已高温消毒20 mm盖玻片置于细胞悬液的培养板中，培养14 h使细胞贴壁生长在玻片。加药组加入10－9mol/L annexin 5，对照组加入含等体积pH8.0的Tris-HCl溶液，34℃继续孵育24 h后，收取细胞爬片，0.01 mol/L PBS冲洗玻片，冷丙酮固定20 min，捞出，并晾干，中性树脂将玻片黏于载玻片。浸入3%过氧化氢/甲醇温育30 min。PBS漂洗 5 min，共 3次。加入兔抗大鼠StarD7抗体(1∶100稀释)，阴性对照用PBS取代兔抗大鼠StarD7抗体。4℃孵育过夜。次日经PBS漂洗5 min，共3次。加入1∶200稀释的羊抗兔IgGHRP，室温温育1 h，PBS漂洗5 min，共3次。滴加DAB显色液显色5 min，自来水充分漂洗，苏木精复染10 s，常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察阳性的间质细胞并拍照。

1.3 统计学分析 所得数据用SPSS 17.0统计软件分析。定量结果以均数±标准差()表示，2组间比较采用配对样本t检验。2组变量间的相关性进行Pearson相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Annexin 5促进睾丸间质细胞中睾酮的分泌放免检测结果显示大鼠睾丸间质细胞经终浓度为10－9mol/L的annexin 5刺激24 h后，细胞培养上清中睾酮的含量升高了 28.3%(22.22±0.66 vs 28.50±0.48)，2 组差异有统计学意义(P ＜0.05)。见图 1。

图1 Annexin 5对睾丸间质细胞睾酮分泌量的影响Figure 1 Effect of annexin 5 on testosterone secretion in Leydig cells

2.2 Annexin 5对StarD7 mRNA表达的影响

2.2.1 大鼠间质细胞总RNA的提取 紫外分光光度计检测，A260/A280的比值均在1.8 ～2.0 之间，表明RNA纯度较好。

2.2.2 PCR结果 大鼠睾丸间质细胞经10－9mol/L的annexin 5刺激24 h后，采用RT-PCR方法测定StarD7mRNA表达水平。结果如图2所示:大鼠睾丸间质细胞中StarD7以及内参Rpl19 RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，可分别见一条长约358bp目的基因扩增条带以及506bp的内参基因扩增条带，片段大小与设计一致。与对照组相比，加药组StarD7 mRNA 的表达增加了44.5%［(1.10 ±0.02)vs(1.59 ±0.09)，P ＜0.05］。

2.3 Annexin 5对 StarD7蛋白表达的影响 用10－9mol/L的annexin 5刺激细胞24 h后，与对照组相比，加药组 StarD7蛋白的表达增加了44.3%(1.49 ±0.10 vs2.15 ±0.16，P ＜0.05)。见图 3。

2.4 Annexin 5刺激间质细胞后睾酮分泌与StarD7蛋白表达之间的相关性分析 睾酮分泌与StarD7蛋白表达之间呈显著正相关，Pearson相关系数 r=0.824(P ＜0.05)。

2.5 StarD7蛋白免疫细胞化学染色结果 细胞免疫细胞化学结果显示StarD7蛋白主要定位在大鼠睾丸间质细胞的细胞质内，细胞核内无StarD7蛋白表达;加药组的间质细胞胞浆内的染色强度明显强于对照组。这与Western blotting结果是一致的。见图4。

图2 Annexin 5对StarD7mRNA表达的影响Figure 2 Effect of annexin 5 on the expression of StarD7 mRNA

图3 Annexin 5对StarD7蛋白表达的影响Figure 3 Effect of annexin 5 on the expression of the StarD7 protein

图4 免疫细胞化学检测大鼠睾丸间质细胞StarD7的表达(×400)Figure 4 Expression of StarD7 in rat Leydig cells by immunocytochemistry(×400)

3 讨 论

雄性动物的睾丸间质细胞是合成睾酮的主要场所［8］。间质细胞是类固醇激素分泌细胞，胞内具有典型类固醇激素分泌细胞的超微结构特征，即发达的滑面内质网、管状嵴线粒体和丰富的脂滴等。睾酮合成的原料是存在于间质细胞线粒体外的胆固醇，胆固醇从线粒体外膜转运到内膜才能参加类固醇激素合成，该过程需要StAR作用于线粒体外膜，介导并促进胆固醇的转运，这是睾酮合成的一个限速步骤［9］。StAR的N端氨基酸序列是线粒体引导肽，C端为生物活性部位，可与脂质或胆固醇结合，该结构域称为 START［10］。

StarD7属于START，其在脂类与类固醇转运、结合中有重要作用，START蛋白家族主要由15种蛋白组成:STARD1～STARD15，并被分为6个亚家族［11］。这些蛋白的特征是一个具有210个氨基酸组成一个球型结构START亚基，亚基中心有疏水区空洞，可与脂类或胆固醇结合［12］。只有部分有代表性的START亚基家族的脂类配体已被识别，如类固醇(StAR)、卵磷脂等。STARD超家族具有一个保守的配体结合亚基的蛋白折叠，除参与脂类转运以外，其还包含细胞膜的靶向蛋白。

本实验室先前的研究已经证实，促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)能上调大鼠睾丸间质细胞中 annexin5和3β-HSD在mRNA水平的表达，且睾酮水平也有显著提高［13］。另有研究发现，重组的大鼠annexin5能以时间和剂量依赖性促进睾酮分泌，ERK MAPK是annexin5调控睾酮合成的关键信号通路［14］，且annexin 5是通过影响P450scc、3β-HSD和17β-HSD的表达来调节睾酮合成的［15］。在体实验也已经证实，腹腔注射annexin 5能促进SD大鼠睾酮分泌，并呈剂量依赖性［16］，是通过提高 P450scc和 3β-HSD 2种关键酶的表达来实现［17］，提示annexin5可能是一种重要的生殖内分泌调节因子，在GnRH调节睾酮合成过程中起着重要作用。本实验室用二维电泳蛋白质组学技术初步建立了annexin 5刺激大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌的差异蛋白谱(另文发表)，筛选出的StarD7可能是影响睾丸间质细胞合成睾酮过程中的关键蛋白，但睾酮水平的提高是否是通过促进StarD7的表达来实现的尚不清楚。

本实验首次在睾丸间质细胞中研究StarD7对睾酮合成的影响。实验中加药组大鼠睾丸间质细胞StarD7在基因水平和蛋白水平上的表达升高，说明annexin 5对StarD7的表达具有促进作用，且StarD7蛋白的表达与睾酮分泌呈显著正相关。而本实验室先前的研究发现annexin 5对StAR蛋白表达没有明显的影响［15］。提示annexin 5可能不是通过 StAR蛋白而是其脂类转运亚基超家族StarD7蛋白来促进睾酮合成的，具体机制有待进一步阐明。本实验也首次在睾丸间质细胞中对StarD7进行定位，免疫细胞化学结果显示StarD7主要分布在大鼠睾丸间质细胞的胞浆中，提示StarD7可能是annexin 5刺激睾丸间质细胞合成睾酮的关键蛋白。StarD7具有脂类与类固醇转运、结合的功能，Angeletti和Rena［18］推测StarD7在胎盘中参与蛋白介导的脂质运输，这一结果与我们根据实验推测StarD7通过与胆固醇结合并转运从而参与调控睾酮合成的观点相一致。最近的研究表明，StarD7促进了细胞内磷脂到线粒体的非囊泡系统的运输［19］，这也进一步提示与StAR介导并促进胆固醇在线粒体上的转运密切相关。

本实验初步证实了StarD7参与annexin 5调控睾丸间质细胞合成睾酮的生理过程，并且推测这种作用可能是与胆固醇相结合并介导和促进胆固醇向线粒体内膜转运而实现的，具体机制尚待进一步探索。

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