miR-181a促进人子宫内膜间质细胞蜕膜化催乳素的表达

张 群，刘红玉，蒋 玥，王 玢，颜桂军，孙海翔，胡娅莉

0 引 言

子宫内膜蜕膜化是胚胎植入及维持妊娠所必须的改变，蜕膜化对胎盘形成及正常功能建立以满足胎儿生长需要起着至关重要的作用。在月经周期的黄体期，受卵巢分泌的雌、孕激素的影响，子宫内膜由增生期向分泌期改变，一旦妊娠，这种分泌期内膜的形态与功能将进一步变化即蜕膜化，主要表现为成纤维样子宫内膜间质细胞变大变圆，并分泌蜕膜化标志性激素——PRL和胰岛素样生长因子结合蛋白-1(insulin-like growth factor binding protein-1，IGFBP-1)［1］。其中子宫内膜间质细胞分泌的PRL通过自分泌和旁分泌作用调控子宫内膜上皮和间质细胞的分化以及胚胎滋养层细胞的增殖和胎盘血管的重塑［2］。同时PRL还可抑制IL-6和20α-羟类固醇脱氢酶(20α hydroxysteroid dehydrogenase，20α HSD)等不利于妊娠维持的相关基因表达［3－4］。

miRNA为真核细胞内非蛋白质编码的内源性RNA，其通过与靶mRNA的3'端非翻译区(3'-UTR)完全或部分互补结合，导致靶mRNA降解或转录后翻译抑制而调控靶基因的表达［5－7］。目前已经发现一些miRNA在胚胎种植“窗口期”和子宫内膜异位症患者内膜组织中存在表达差异［8］。其中miR-181a在子宫内膜异位症患者子宫内膜组织中表达明显降低，并受雌、孕激素的调节，近期研究发现miR-181a通过调控p27 mRNA等靶基因的翻译参与多种细胞分化的调节［9－11］。但是，miR-181a对 hESC 的分化及蜕膜化标志基因PRL的表达调控尚不清楚。

为探讨miR-181a对人子宫内膜蜕膜化可能的调节作用，我们制备了高感染效率的miR-181a腺病毒并感染hESC，通过实时定量PCR、荧光素酶报告基因及化学发光免疫法检测miR-181a对蜕膜化标志基因PRL的调控作用，为研究miR-181a在蜕膜化过程中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 DMEM/F12培养液、FBS和青链霉素等细胞培养试剂、Lipofectamine2000转染试剂和PlatinumⓇPfx DNA聚合酶均购自Invitrogen公司;Vimentin抗体和Pancytokeratin抗体购自Santa Cruze公司;限制性内切酶PacⅠ购自NEB公司;Adeno-X Rapid Titer Kit购自Clontech公司;Dual-Luciferase Reporter Assay Kit购自Promega公司。

1.2 实验动物处理 10～12周SPF级ICR小鼠，雌鼠75只(体重30～36g)，雄鼠35只(体重38～44g)，购于江苏省扬州大学实验动物中心，饲养于南京大学医学院附属鼓楼医院动物实验中心。实验动物许可证号:SYXK(苏)2009－0017。于人工条件下饲养，室温22℃，照明采用12 h明/暗光照周期，可自由饮水和进食。

适应性喂养3～5d后，随机取出5只雌鼠作为未孕组，并标记为妊娠第0天(0 day post coitus［dpc］)，即0dpc，余雌鼠按照2∶1 比例与雄鼠合笼，次日观察雌鼠有阴道栓者标记为妊娠第0.5 d(0.5 days post coitus［dpc］)，即0.5dpc)，并按此方法依次计算妊娠天数。随机取出35只孕鼠，将其随机分为7组，每组5只。分别饲养至不同妊娠天数(标记为0.5dpc、1.5dpc、2.5dpc、3.5dpc、4.5dpc、5.5dpc、6.5 dpc)，采用颈椎脱臼法处死小鼠，收集小鼠子宫组织;依Trizol试剂盒所提供方法进行子宫组织总RNA抽提，RNA经定量和1%琼脂糖甲醛变性胶凝胶电泳检测RNA完整性后，取1μg RNA用于检测不同孕龄母鼠子宫组织中miR-181a的表达。

1.3 重组腺病毒 Ad-miR-181a 的制备与纯化［12－13］经PCR扩增获得含有has-miR-181a前体序列的cDNA，上游引物为5'-CGCGCTCGAGATACAATGTGATGTGGAGGTT-3'，下游引物为5'-GCGCGATATCGGCCACAGTTGCATTCATTGT-3'。将PCR产物采用XhoⅠ和EcoRV双酶切后克隆至rpSilence-CMV穿梭质粒中。rpSilence-CMV-miR-181a重组质粒经酶切鉴定和DNA测序鉴定正确后，为进行腺病毒颗粒的包装，采用转染试剂Lipofectamine2000将经PacⅠ酶切线性化的重组质粒和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转染至HEK293A细胞。转染后第6天细胞发生细胞病变效应(Cytopathic Effect，CPE)，转染后第9天293A细胞大约有70%从培养皿底脱落，表明已有大量重组的腺病毒产生，收集重组Ad-miR-181a腺病毒颗粒，在HEK293A细胞中扩增后，经CsCl梯度高速离心纯化，分装于含10%甘油的20 mmol/L Tris缓冲液，－70℃保存。同时抽提病毒DNA采用PCR鉴定重组病毒。

1.4 hESC 的分离、培养及体外蜕膜化诱导培养［14－15］收取正常育龄妇女分泌期的新鲜子宫内膜组织，无菌条件下将其剪成约1 mm3碎屑，采用0.1%胶原酶Ⅰ37℃消化20 min，轻轻吹打至细胞分散，为去除未消化的组织碎片和腺上皮细胞，采用500目无菌不锈钢网过滤。滤过液采用800×g离心细胞悬液5 min，弃上清，用含 10%碳吸附 FBS(charcoal stripped FBS)的DMEM/F12培养液重新悬浮细胞，将获得的细胞按照2×106个细胞接种于直径100 mm细胞培养皿中，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，为除去未贴壁的间质细胞和血细胞，次日更换全部培养液后，常规条件下培养。经抗vimentin和cytokeratin免疫组化鉴定获得的人子宫内膜间质细胞纯度后(＞95%)，进行维持培养及体外蜕膜化诱导培养。

获取纯度较高的hESC(2～4代)，待细胞长至60%汇集时，为进行体外蜕膜化诱导培养，将血清浓度减至 2.5%，同时添加 1 μmol/L MPA(Sigma)和0.5 mmol/L 8-Br-cAMP(Sigma)。

1.5 荧光素酶报告基因实验 待hESC生长至60%汇集时，分别感染Ad-LacZ和Ad-miR-181a腺病毒［多重性感染(multiplicity of infection，MOI)=50］，6 h后将培养液更换为含2.5%碳吸附胎牛血清的培养液，37℃培养24 h后，采用FuGENE HD转染试剂(Roche公司)将300 ng pGL3-dPRL/－332-Luc报告基因质粒(本实验室保存)和20 ng phRLTK内参质粒瞬时转入细胞中。转染48 h后收集细胞，按照Dual-Luciferase Reporter Assay Kit所述方法裂解细胞，进行荧光素酶报告基因实验。为了消除转染效率间的差异，我们同时采用海肾荧光素酶的活性作为内参对照。

1.6 实时定量(Real-time Quantitative)-PCR hESC长至60%汇集时，分别感染Ad-LacZ和AdmiR-181a腺病毒(MOI=100)，病毒感染6 h后更换含有10%碳吸附 FBS的培养液，24 h后更换含2.5%碳吸附胎牛血清的培养液，同时添加1 μmol/L MPA和0.5 mmol/L 8-Br-cAMP进行体外蜕膜化诱导培养，37℃、5%CO2培养箱中培养3～9 d。根据Trizol试剂盒(Invitrogen公司)所提供方法提取细胞总RNA，1%琼脂糖甲醛变性凝胶电泳验证RNA完整性及RNA定量后，取1 μg RNA经微小RNA特异性反转录引物反转录成cDNA后用于miR-181a和U6等微小RNA的PCR扩增。微小RNA PCR扩增条件:95℃预变性15 min，95℃变性10 s，60℃退火1 min，循环40次。1 μg RNA经随机引物反转录用于PRL和18 S rRNA等基因的PCR扩增。基因PCR扩增条件:95℃预变性3 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环40次，95℃延伸1 min，在实时定量PCR仪(MyiQ Single Color Realtime PCR Detection System，BIORAD)上进行反应，采用2-△△CT方法计算基因表达的相对比值。miR-181a反转录引物为:5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTCACCG-3';U6反转录引物为 :5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。Real-time PCR引物序列miR-181a上游引物:5'-ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACGCTGTCG-3'，下游引物:5'-GGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3';U6上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3';18S上游引物:5'-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3'，下游引物:5'-CTGGAATTACCGCGGCT-3';PRL上游引物:5'-CACTACATCCATAACCTCTC-3'，下游引物:5'-ATGCTGACTATCAAGCTCAG-3'。

1.7 PRL测定 hESC感染 Ad-miR-181a腺病毒24h后，将血清减至2.5%并添加1 μmol/L MPA(Sigma)和0.5 mmol/L 8-Br-cAMP(Sigma)进行体外蜕膜化诱导培养，分别在第3、6和9天后收集细胞培养液上清，800×g离心5 min以去除细胞碎片后，收集上清存放于－80℃以备检测上清中PRL含量。采用Vidas prolactin kits(Mini-Vidas V.B 02.96 system，bioMe'rieux)检测细胞培养液上清中PRL的浓度。

1.8 统计学分析 采用SPSS 16.0统计软件分析数据，定量数据以均数±标准差()表示。2组均数比较采用t检验;多组均数比较采用单因素方差分析，如各组总体方差相等，两两比较采用LSD检验;如各组方差不齐，则采用Dunnett's T3进行两两比较，以P≤0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 围着床期孕鼠子宫组织中miR-181a表达的变化 早孕小鼠子宫中miR-181a的表达高于非妊娠小鼠子宫，在怀孕1.5～6.5 dpc小鼠子宫中miR-181a表达量增加，在小鼠着床“窗口期”即孕4.5 dpc达到峰值(增加约 2.6 倍)，孕 5.5 dpc开始下降。见图1。

图1 miR-181a在围着床期小鼠子宫组织中表达(n=5)Figure 1 Expression of miR-181a in the uterus of pregnant mice(n=5)

2.2 Ad-miR-181a重组腺病毒的制备与纯化 使用针对miR-181a基因特异性引物通过PCR扩增获得携带miR-181a前体序列约460 bp的cDNA(图2a);该PCR产物经XhoⅠ和EcoRⅤ双酶切后克隆至rAdpsilence-CMV 1.0载体，获得 rAd-psilence-CMV-miR-181a穿梭质粒(图2b)。经酶切与测序验证正确后进行病毒包装，获得滴度为5.9×1010ifu/ml的重组miR-181a腺病毒。

图2 Ad-miR-181a重组腺病毒构建Figure 2 Construction of recombinant Ad-miR-181a shuttle plasmid

2.3 高表达miR-181a上调蜕膜化标志基因PRL的表达 实时定量PCR结果显示，hESC在无MPA和8-Br-cAMP体外蜕膜化诱导作用下，腺病毒介导的miR-181a高表达，见图3a;促进hESC中PRL mRNA表达水平增加超过8倍，见图3b;同时AdmiR-181a可协同促进MPA和8-Br-cAMP联合诱导所致的hESC中PRL mRNA表达水平的增加，见图3c。

图3 过表达miR-181a促进蜕膜化标志基因PRL mRNA的表达(n=5)Figure 3 PRL mRNA expression induces by the overexpression of miR-181a(n=5)

2.4 高表达miR-181a促进hESC分泌PRL 如图4所示，在8-Br-cAMP联合 MPA体外诱导的hESC蜕膜化过程的第6天 PRL［(24.43±3.46)vs(58.64 ± 4.68)，P ＜ 0.05，n=4］和第 9 天 PRL［(33.82 ±4.59)vs(84.82 ±9.23)，P ＜0.05，n=4］的表达与分泌明显增加，有统计学意义。2.5 Ad-miR-181a激活蜕膜化特异性基因PRL启动子活性 荧光素酶报告基因实验进一步表明，过表达 miR-181a(MOI=50)可明显上调 hESCs中PRL(－332/+65)启动子活性达到2倍，提示miR-181a可能通过调控间质细胞中某些分子参与蜕膜化标志基因PRL的表达调控。见图5。

图4 过表达miR-181a促进子宫内膜间质细胞中PRL的分泌(n=4)Figure 4 Secretion of PRL in hESCs increased by the overexpression of miR-181a(n=4)

图5 miR-181a对蜕膜化特异性基因PRL启动子活性的影响(n=5)Figure 5 Decidual PRL promoter(－332/+65)activity enhanced by miR-181a(n=5)

3 讨 论

miRNA是真核细胞内一类新的小分子RNA，是基因表达、修饰、转录和翻译的调节者，主要通过基因转录后水平的调控参与调节包括能量代谢、细胞增殖与分化、细胞生长与凋亡等多个生理与病理过程。MiR-181a作为转录后调控 mRNA的微小RNA，在一些领域已有报道，研究发现miR-181a参与了造血干细胞、成肌细胞、骨髓细胞以及B细胞和T细胞的分化调节，是细胞分化的重要调控器［11，16－17］。我们的研究发现早孕小鼠子宫组织中miR-181a的表达高于非妊娠小鼠子宫，在怀孕1.5～6.5 d小鼠子宫中 miR-181a表达量增加，在小鼠着床“窗口期”即孕4.5 dpc达到峰值，并在孕5.5 dpc其表达开始下降，提示miR-181a可能参与到妊娠过程中子宫内膜蜕膜化过程。子宫内膜间质细胞蜕膜化是一个多基因参与调控的子宫内膜间质细胞增殖与分化过程，对胚胎的着床、胎盘功能的维持及胎儿的生长具有重要作用。虽有文献报道雌、孕激素可调节子宫内膜间质细胞中miR-181a的表达［8］，但miR-181a在子宫内膜细胞中的功能尚不清楚。

为了探讨miR-181a在子宫内膜间质细胞蜕膜化过程中的作用，成功制备了高表达miR-181a的腺病毒。同时实时定量PCR结果表明腺病毒介导的miR-181a高表达可促进hESCs中PRL mRNA的表达;在8-Br-cAMP和MPA联合诱导hESCs体外蜕膜化时，miR-181a可明显增加8-Br-cAMP联合MPA诱导的PRL mRNA水平的表达与PRL蛋白的分泌。荧光素酶报告基因实验进一步证实miR-181a可以激活 PRL promoter的活性。上述研究提示 miR-181a参与了8-Br-cAMP和MPA联合诱导hESCs体外蜕膜化PRL的调控。

蜕膜PRL是胚胎植入与妊娠的关键，蜕膜化的间质细胞开始持续表达蜕膜PRL直至分娩。目前已知孕酮受体(progesteronereceptor，PGR)、FOXO1、HOXA10、Nur77等转录因子相互协调精确调控 dPRL 的表达与分泌［13，18－20］。近期研究发现转化 生 长 因 子 β1(transforming growth factor-β1，TGFβ1)作用于hESCs后可明显抑制蜕膜化PRL的表达与分泌，并且将TGFβ1经典的SMAD信号通路中共结合分子SMAD4干扰后，可完全消除TGFβ1对蜕膜化PRL的抑制作用，因此证实了TGFβ1可通过SMAD通路抑制hESCs中蜕膜化PRL的表达与分泌［21］。TGFβ1 是 TGFβ 超家族成员之一，主要通过与细胞膜上的Ⅱ型受体结合，从而导致Ⅰ型受体磷酸化，Ⅰ型受体磷酸化细胞内信号传导分子Smad2/3，磷酸化的Smad2/3与Smad4结合之后转移至细胞核内，参于靶基因的表达调控［22］。通过生物信息学分析发现TGFβR1为miR-181a的预测靶基因，因此，我们推测 miR-181a可能通过与TGFβR13'UTR结合，抑制子宫内膜间质细胞中TGFβR1蛋白的表达，从而促进hESCs中dPRL的表达，但具体调节机制有待进一步研究证实。

综上所述，我们首次发现并证实miR-181a可促进hESCs中dPRL的表达与分泌，为研究miR-181a在子宫内膜异位症患者子宫组织中异常表达致胚胎植入失败的可能机制奠定基础，但具体的调节机制有待进一步研究。

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