黄连素诱导人乳腺癌MCF－7细胞凋亡及其相关的氧化应激机制

谢 娟，黄新艳，许银燕，王 俐

0 引 言

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升，已成为妇女健康的最大威胁［1－2］。乳腺癌的发病率虽高，但其病程进展缓慢，自然生存期长，准确有效的治疗可显著提高乳腺癌患者的生存率。当前，乳腺癌的治疗以手术为主辅以化疗，但辅助化疗常会出现许多不良反应，因此寻找治疗乳腺癌的安全有效的药物显得极其紧迫和必要［3］。黄连素又称小檗碱，研究发现它能治疗各种感染性疾病外，其具有氮三角的化学结构，使其在抗肿瘤方面也显示了很好的活性，并因黄连素具有药源广泛易得，价格低廉、无不良反应、使用安全、方便等优势，黄连素必定会有更加广阔的临床应用前景［4］。目前学术界针对黄连素的抗肿瘤机制还缺乏确切的研究。本研究观察不同浓度黄连素作用后人乳腺癌MCF－7细胞的氧化应激状态及其与细胞生长、凋亡的关系，并进一步探讨其抗肿瘤作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 人乳腺癌MCF－7细胞株来源于南京医科大学生物学与医学遗传学系，江苏省人类功能基因组学重点实验室。黄连素购自武汉福鑫化工公司，纯度97.85%，相对分子质量 407.85，以温热的去离子水溶解，加入含10%胎牛血清的DMEM中，稀释到所需浓度，置－20℃避光保存。胎牛血清购自四季青生物技术公司，DMEM培养液购自Gibco BRL公司，MTT及2，7－二氯荧光黄双乙酸盐购自 Sigma 公司，5，5＇，6，6＇－四氯－1，1＇，3，3＇－四乙基苯丙咪唑羰花青碘化物(JC－1)购自invitrogen公司。

1.2 细胞培养 将MCF－7细胞接种于75ml细胞培养瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养，3d传代1次。

1.3 MTT法检测黄连素对细胞增殖能力的影响取对数生长期细胞消化、以4.0×104/孔的密度接种于96板中，培养24 h后，按黄连素浓度0、10、25、50、75、100 μmol/L 分为 6 组，每组设4 个复孔，分别加入含黄连素的培养液200 μl继续培养48 h，然后弃含药物培养液，每孔分别加入不含药物新鲜培养液180 μl，置于细胞培养箱中平衡30 min，每孔加入MTT 溶液(5mg/ml)20μl，继续正常培养2.5h，吸弃每孔培养液上清，每孔加入150 μl DMSO中止培养，在水平摇床上振荡10 min，使结晶物充分溶解，选择490 nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度值，以吸光度值的高低反应细胞增殖的能力，吸光度值越高，细胞增殖能力越强。

1.4 Hochest 33342核染料检测细胞核形态 取对数生长期细胞消化、以4.0×104/孔的密度接种于24 孔板中，培养24h 后，按黄连素浓度0、10、25、50、75、100 μmol/L分为6组，每组设2个复孔，分别加入含黄连素的培养液1 ml继续培养48 h。加入终浓度为10 μg/ml的Hoechst 33342荧光染料至药物处理后的细胞中，37℃孵育5 min，4%甲醛固定12 min，用PBS清洗2次后在荧光显微镜下观察结果。结果判断:正常细胞的核、细胞质呈弥散均匀荧光;凋亡细胞的核或细胞质内可见浓染致密颗粒、块状荧光和核裂解块状荧光。随机选取5个视野(总细胞数＞400)，计算凋亡率。

1.5 DCFH-DA荧光探针检测黄连素处理后MCF-7细胞内ROS水平 MCF－7细胞内ROS水平通过DCFH－DA的氧化进行检测。荧光探针DCFH－DA溶于DMSO，10 mmol/L，－20℃避光保存，临用前用DMEM稀释500倍至20 μmol/L孵育细胞。黄连素孵育 MCF－7 细胞不同的时间(0、1、3、6、12、24 h)，进而以20μmol/L DCFH－DA荧光探针继续孵育30 min后，吸弃上清，4%甲醛固定12 min，用PBS清洗2次后在荧光显微镜下观察结果。激发波长为485 nm，发射波长为530 nm。每孔随机选取6个视野，Image pro－plus 6.0分析软件分析其平均荧光强度。

1.6 JC-1荧光探针检测黄连素处理后 MCF-7△Ψm的水平 MCF－7细胞△Ψm采用荧光探针JC－1进行检测。在490 nm荧光激发下，当△Ψm呈极化状态时，JC－1主要以J聚体形式存在，表现为橙红色荧光;当△Ψm去极化时(即△Ψm水平下降)，JC－1主要以单体存在，表现为绿色荧光。黄连素孵育 MCF－7 细胞不同的时间(0、1、3、6、12、24h)，细胞与5μmol/L JC－137℃孵育10min后，DMED 培养液洗涤2遍，荧光显微镜(Nikon，Japan)下成像检测(激发波长为490 nm，发射波长520 nm)。

2 结 果

2.1 黄连素处理致人乳腺癌MCF-7细胞活力降低 给予不同浓度黄连素(0、10、25、50、75、100 μmol/L)孵育MCF－7细胞48 h，MTT法检测不同浓度黄连素对MCF－7细胞活力的影响。结果如图1，表1所示，低浓度的黄连素(10 μmol/L)即对细胞活力有抑制作用(P＜0.05)，随着黄连素浓度的增加，细胞活力抑制作用显著增加，呈浓度依赖性。

图1 不同浓度黄连素对MCF-7细胞活力的影响Figure 1 Effects of different concentrations of berberine on the motility of MCF-7 cells

表1 不同浓度黄连素对MCF-7细胞活力的影响Table 1 Effects of different concentrations of berberine on the motility of MCF-7 cells

2.2 黄连素处理诱导人乳腺癌MCF-7细胞的凋亡 给予不同浓度黄连素(0、10、25、50、75、100 μmol/L)孵育 MCF－7 细胞 48 h，用 Hochest33342 荧光染料核染色，荧光显微镜下观察MCF－7细胞凋亡情况。凋亡的细胞表现为细胞核染色质聚集、致密、浓染、荧光增强、细胞核染色质固缩或碎裂成2块以上，见图2，图3。表2所示:黄连素呈浓度依赖性诱导MCF－7细胞凋亡率增加。以下实验选用黄连素50 μmol/L进一步研究其可能的抗肿瘤机制。

图2 不同浓度黄连素作用下MCF-7细胞核荧光染色(×200)Figure 2 Effects of different concentrations of berberine on the nuclear morphology of MCF-7 cells(×200)

图3 不同浓度黄连素对MCF-7细胞凋亡率定量分析Figure 3 Effects of different concentrations of berberine on the apoptosis of MCF-7 cells

表2 不同浓度黄连素对MCF-7细胞凋亡的影响Table 2 Effects of different concentrations of berberine on the apoptosis of MCF-7 cells

2.3 黄连素处理诱导人乳腺癌 MCF-7细胞内ROS生成增多 为探讨黄连素诱导MCF－7细胞凋亡可能与诱导细胞内大量ROS生成有关，以DCFHDA探针检测黄连素50μmol/L孵育MCF－7细胞不同的时间(0、1、3、6、12、24 h)，细胞质内 ROS 生成的变化。如图4所示，50μmol/L黄连素孵育MCF－7细胞，ROS与荧光探针作用发出的绿色荧光强度随黄连素作用时间的延长而增加，并在黄连素作用6 h达到高峰。如图5，表3所示，与对照组比较，MCF－7细胞黄连素孵育6h细胞质内ROS生成增多至1.54倍。

图4 黄连素50 μmol/L处理不同时间后的MCF-7细胞(×200)Figure 4 MCF-7 cells treated with berberine at different times(×200)

图5 黄连素诱导MCF-7细胞内ROS的生成Figure 5 Berberine-induced production of intracellular ROS in MCF-7 cells

表3 黄连素诱导MCF-7细胞内ROS的生成Table 3 Berberine-induced production of intracellular ROS in MCF-7 cells

2.4 黄连素处理诱导人乳腺癌 MCF-7细胞△Ψm降低 细胞质内大量ROS生成可诱导△Ψm降低，进而诱导凋亡。本实验应用JC－1探针检测黄连素50 μmol/L孵育MCF－7细胞不同的时间(0、1、3、6、12、24 h)，MCF－7 细胞△Ψm 的变化。荧光显微镜(Nikon，Japan)下成像当△Ψm呈极化状态时，JC－1主要以J聚体形式存在，表现为橙红色荧光;当△Ψm去极化时(即△Ψm水平下降)，JC－1主要以单体存在，表现为绿色荧光。结果如图6所示:黄连素50 μmol/L孵育MCF－7细胞不同的时间(1、3、6、12、24 h)与对照组相比，均由橙色荧光变为绿色荧光。

图6 黄连素诱导MCF-7细胞线粒体膜电位的降低(×200)Figure 6 Berberine-induced mitochondrial depolarization of MCF-7 cells(×200)

3 讨 论

黄连素是一种历史悠久的抗炎中药提取物，其抗微生物及原虫作用明确，临床现多用于治疗肠炎、细菌性痢疾等胃肠疾病。近年来随着药理学及生物学的发展，关于黄连素的研究发现其对许多肿瘤均有治疗作用，包括骨肉瘤［5］、前列腺癌［6］、肝癌［7］等。本文研究显示，黄连素作用于人乳腺癌MCF－7细胞48 h，呈浓度依赖性至细胞活力降低，诱导细胞凋亡。

ROS是线粒体呼吸链中电子转运的副产物，细胞色素氧化酶还原一分子的氧气即有4个电子逸出，游离的电子将伴随着呼吸链的全部过程并可还原分子氧形成 ROS［8－9］。生理水平的 ROS是细胞正常活动所必须的，它参与许多细胞事件包括细胞增殖、糖转运以及脂质合成等的调节。但细胞内ROS生成超过一定的阈值，其可直接损伤细胞，诱导细胞死亡［10］。其主要机制包括:攻击蛋白、多糖、脂质双分子层以及DNA，导致DNA链断裂、变形、交联，影响肿瘤细胞正常生理功能的发挥，最终导致细胞的变性坏死或启动一系列信号分子机制诱导细胞凋亡［11］。最近的研究显示许多经典的抗肿瘤药包括紫杉醇，诱导肿瘤细胞ROS大量生成是其重要的抗肿瘤机制［12］。ROS已成为发展抗肿瘤药物的主要靶标。Barreto等［13］报道黄连素带有的季氨氮基团利于其穿透生物膜，使药物在细胞器，特别是线粒体内聚积。细胞内高浓度黄连素通过抑制NADH氧化酶和琥珀酸脱氢酶活性，使线粒体呼吸链受阻，导致细胞利用氧障碍，大量的羟自由基、超氧阴离子等会持续不断的产生、积聚。本实验研究显示黄连素处理人乳腺癌MCF－7细胞可诱导细胞内短时间ROS大量生成。线粒体既是ROS生成的主要部位，同时也是ROS攻击的主要靶标，线粒体内的ROS生成过多，ROS大量聚积，最终导致线粒体氧化损伤。△Ψm丢失是细胞凋亡过程中的重要事件，△Ψm丢失可导致细胞色素C及细胞凋亡诱导因子大量释放，进而活化线粒体及非线粒体的凋亡途径，继而诱导细胞凋亡［14］。本研究显示黄连素诱导乳腺癌MCF－7细胞内ROS大量生成同时伴随着△Ψm降低，提示黄连素可能通过诱导胞内ROS大量生成进而损伤线粒体功能，诱导△Ψm降低，活化一系列凋亡通路进而发挥抗肿瘤作用。

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