EML4-ALK在非小细胞肺癌中的研究进展

赵 明综述，宋 勇审校

0 引 言

在全球范围内，肺癌是发病率最高和死亡率最高的恶性肿瘤［1］，其中NSCLC发病率占所有肺癌发病率的80%，每年新发肺癌病例约为150万。一系列研究表明，棘皮动物微管相关蛋白4(echinoderm microtubule-associated protein-like 4，EML4)-间变性淋巴瘤酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)在肺癌患者中的阳性率约为3% ～8%［2］，据此估算全球每年新发的肺癌患者中大约有70000人的发病可能与EML4-ALK基因相关。EML4-ALK基因的发现及相关研究是2009年NSCLC的10大事件之一。现已将EML4-ALK作为新的NSCLC诊断标志和治疗靶标［3］。

1 EML4-ALK的研究背景

在所有的肿瘤发病因素中，染色体易位约占20%［4－5］。融合基因即为染色体易位的产物，是淋巴系统、血液系统、结缔组织肿瘤的主要致病因素之一［6］，但融合基因所致的实体瘤较为少见。2007年，Soda等［7］在Nature报道发现了1种可以诱发肺癌的融合基因，在2号常染色体短臂上转化形成，其N末端由EML4基因编码，C末端由ALK基因编码。在动物模型实验中，EML4-ALK位于转染细胞的细胞质，可诱导大鼠3T3细胞转化为肿瘤细胞。将EML4-ALK注射于裸鼠时可诱发肿瘤。随后在Inamura等［8］及Shinmura等［9］的研究中，发现 EML4-ALK 在 NSCLC患者中表达的阳性率为0.9% ～2.6%，而其他的实体瘤中表达均为阴性［10］。

2 EML4-ALK融合基因的结构

目前已证实EML4包含卷曲螺旋区域的部分是使融合基因具有转化能力的基本区域，与ALK形成二聚体后间接激活该融合基因［11］。迄今已在肺癌细胞中鉴定出多种EML4-ALK融合基因的变异体，所包含的EML4具有不同的截点，这些截点位于外显子2、6、13、14、15、18、20 区域，而 ALK 基因的截点只存在于外显子20的区域。这些变异体都具有生物学功能［12］。有文献报道［13］在乳腺和肠道肿瘤中也检测出了EML4-ALK基因变异体，但不同变异体的临床意义尚未明确。在诸多EML4-ALK变异体中，检出率最高者为变异体1和变异体3，即E13:A20和E6a/b:A20。在EML4-ALK阳性的患者中，变异体1的阳性率约为33%，变异体3的阳性率约为29%，变异体2的阳性率约为9%，这3种变异体占所有变异体的大多数，其他的多种变异体所占比例均较低［7，8，11，13，14－16］。

3 EML4-ALK融合基因的检测方法

核磷蛋白(nucleophosmin，NPM)-ALK融合基因是在间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large cell Lymphoma，ALCL))中发现的，也是最早发现的ALK融合基因.目前已有多种较为成熟的检测NPM-ALK的方法。如免疫组化、荧光原位杂交、逆转录-聚合酶链反应 (reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)等，但上述各种方法都不够简便、快速，检测方法尚未标准化，故影响EML4-ALK在临床诊断和治疗中的应用。

3.1 免疫组化 临床通常将活组织检查和外科手术切除的病灶标本采用免疫组化方法检测EML4-ALK基因，是一种较简便实用的检查手段。该法可在不损伤细胞结构特征的条件下，通过检测肿瘤特异性抗原的表达与正常组织鉴别。在ALCL中用针对细胞内区域的ALK抗体来筛选NPM-ALK阳性的淋巴瘤，已作为常规的检测方法［17］，但这种方法不适用于EML4-ALK的检测，可能是由于EML4基因启动子与NPM基因相比活性较弱，EML4-ALK蛋白与NPM-ALK蛋白相比稳定性较差所致。EML4-ALK基因在NSCLC中的表达较低［18］。而且 EML4-ALK变异体较多，难以进一步检测。与外科手术切除标本相比，肺组织活检标本中EML4-ALK基因的检测敏感性可能更低，结果更局限。Mino-Kenudson等［19］近期报道，在常规免疫组化检测的基础上，用D5F3抗体在一定实验条件下在153例肺腺癌患者中检测EML4-ALK的表达，结果显示有较高的敏感性和特异性。用D5F3抗体的检测方法尚有待更多样本的研究验证。

3.2 荧光原位杂交 荧光原位杂交是通过不同颜色的荧光信号来检测基因重排的ALK.用2种不同标记的探针检测ALK基因断裂点的相对两端，正常的ALK显示出黄色信号，而发生重排的ALK显示出分离的红色和绿色信号。只要ALK发生基因重排均可检出。目前对ALCL检测所使用的探针也适用于肺癌的检测。但这种检测方法使样品组织的形态受到破坏。而且该法所观察到的信号不能区分不同的EML4-ALK的变异体。荧光原位杂交对ALK的检测尚需进一步研究。

3.3 RT-PCR RT-PCR检测是一种快速的、敏感的诊断ALK融合基因的方法，但该法需要高纯度的mRNA，而临床上多数患者的组织标本都用福尔马林固定、蜡块包埋，难以提取出高质量RNA。而且由于EML4-ALK的变异体较多，要检测所有已知融合基因的转录产物，需要多组引物才能完成。Martelli等［15］在用 RT-PCR 检测 EML4-ALK 时，发现较多假阳性。RT-PCR技术对实验室有较高要求，难以使EML4-ALK检测成为常规项目。

4 EML4-ALK的临床研究进展

目前关于EML4-ALK的临床研究大多数是在亚洲人中进行。Martelli等［15］和 Perner等［16］也在欧洲人中进行了相关的研究，结果大致相似。也对NSCLC各亚型患者进行了检测。大多数研究数据表明，EML4-ALK的阳性率与患者是否吸烟有很大相关性，同时也与年龄、腺癌、EGFR和KRAS是否突变等因素相关。各研究报道所发现的临床相关因素见表1。

表1 EML4-ALK的临床相关因素研究Table 1 Research on the clinical relative factors of EML4-ALK

4.1 EML4-ALK与吸烟的相关性 早在2007年就从1名吸烟的老年肺癌患者中分离出的EML4-ALK基因，随后的一系列研究表明，在不吸烟或轻度吸烟(＜10包/年)的NSCLC患者中EML4-ALK阳性率更高。Sasaki等［13］统计了8个包括亚洲人、欧洲人的大样本临床研究，共1276例，不吸烟或轻度吸烟的NSCLC患者中EML4-ALK表达阳性率高达9.4%，而在吸烟的 NSCLC患者中，阳性率只有2.9%，差异有统计学意义(P ＜0.0001)。

4.2 EML4-ALK与EGFR、KRAS的相关性 在表1中所列关于EML4-ALK的研究中，多数研究结果显示EML4-ALK基因阳性的患者EGFR、KRAS检测均为野生型。Wong等［11］对 266例肺癌标本中EML4-ALK、EGFR、KRAS 3种基因的阳性率进行比较及统计学分析，结果表明野生型EGFR、KRAS者有119例，其中包括13例EML4-ALK基因表达阳性的患者，差异也有统计学意义。Inamura等［8］也获得相似的结论。仅Koivunen等［22］发现有1例患者检测出EGFR突变和EML4-ALK阳性共存。但2009年Shaw等［14］的研究仍然支持EML4-ALK基因阳性者无EGFR、KRAS突变。这些结果为临床对肺癌患者进行分子靶标检测的选择提供了依据。

4.3 ALK抑制剂的相关研究 EGFR突变的患者使用酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)治疗后，可抑制肿瘤细胞生长，甚至使肿瘤细胞死亡。ALK抑制剂能否抑制EML4-ALK阳性的肿瘤生长受到研究者关注。Soda等［7］报道在发现EML4-ALK时，相关的体外实验表明ALK的抑制剂也能够显著控制EML4-ALK转染的BA/F3细胞的生长。以后具有更高特异性和更强治疗效果的ALK抑制剂陆续发现，包括TAE684和PF02341066等［22－23］。Koivunen 等［24］研究了 TAE684 的作用，发现TAE684对ALK的抑制具有高度的选择性。对含有 EML4-ALK的 H3122、H2228和 DFC10323种细胞系中，TAE684只能有效地控制H3122细胞系的生长，而对H2228和DFC1032细胞系无效，因为这2种细胞系同时含有EGFR和 KRAS突变。PF02341066是口服的MET/ALK双因子抑制剂，目前已处于临床研究阶段。在 Kwak等［25］进行的PF02341066的Ⅰ期临床试验中，19例晚期肿瘤患者的有效率达到53%，疾病控制率达到79%。其副作用为乏力、恶心、呕吐、腹泻等。鉴于其良好的疗效和安全性，美国FDA批准该药可跨过Ⅱ期临床试验，直接进入Ⅲ期临床试验。据报道目前的Ⅲ期临床试验是通过比较PF02341066和标准的二线化疗药物培美曲塞或多西他赛的无进展生存期(progression-free survival，PFS)评估其疗效。另一项II期临床试验是选择不适合进入III期试验的患者或化疗后病情进展的患者，服用PF02341066观察疗效。此外，人血清肿瘤标志物之一多效生长因子(pleiotrophin，PTN)也能与 ALK结合，活化下游的MAPK和PI3K信号通路，影响肿瘤发生［26］。ALK的作用机制明确，其最主要的特点是有明确的作用靶点和明确的靶人群，可以实现有的放矢的治疗模式。目前ALK对NSCLC的靶向治疗进展迅速，前景良好。

5 结 语

将目前现有的化疗方案与新的分子靶向药物结合，可为 NSCLC 患者带来新的希望［27－28］。随着EML4-ALK以及其他分子靶点药物研究的进展，可根据不同基因突变的阳性率，按照KRAS、EGFR、EML4-ALK和其他靶点的先后顺序进行筛选，根据检测结果来选择针对特定NSCLC患者效果最好、副作用最小、最经济的个体化治疗。EML4-ALK已作为NSCLC诊断和治疗的重要靶分子。ALK抑制剂也已成为肺癌个体化治疗的新的有效药物，也为不能耐受化疗的患者提供了新治疗方式。

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