牙髓干细胞多向分化能力的研究进展

张智慧，郭 阳综述，胡伟平审校

0 引 言

干细胞根据其来源不同，分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞具有自我更新能力，在一定条件下能分化成特定的组织，又可实现跨胚层分化发育，即分化成在发育上与其无关的其他组织的细胞类型，称为可塑性或横向分化［1］。Gronthos等［2］研究发现，人牙髓组织中存在一类未分化前体细胞，它们可终末分化为成牙本质细胞，并分泌细胞基质。将其与骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells，BMSC)进行对照研究发现，它们同样具有成体干细胞横向分化的潜能，并将其命名为DPSC。本文就外胚层来源的DPSC分化研究进展做一综述。

1 DPSC多向分化

1.1 向外胚层细胞分化

1.1.1 向神经细胞分化 Agens等［3］第 1周用20 ng/ml表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、40 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，第 2、3 周分别加入40 ng/ml FGF 和 0.5 μmol/L 全反氏维甲酸，体外诱导成人DPSC后均出现神经元形态，实时定量PCR和免疫组化检测到早期神经表面标记巢蛋白(nestin)、微管蛋白Ⅲ(tubulin-Ⅲ)和成熟神经表面标记NF-M、NF-H在基因和蛋白水平的表达。电生理学检测到Na+通道系统有8.5倍的内向电流增加，这与Biella等［4］研究结果一致，Na+通道系统的变化与神经干细胞的分化产生动作电位的能力有关，电压依赖性Na+电流被用于电标记评估成熟的神经元分化。

1.1.2 向角膜上皮细胞方向分化 角膜缘干细胞(limbal stem cell，LSC)位于角膜和巩膜之间过渡的区域，在眼表面损伤时，能促进角膜上皮的不断更新和再生，甚至重建整个角膜上皮，它具有高度特异性，但数量十分有限。Monteiro等［5］用免疫学技术检测发现，人未成熟DPSC(hIDPSC)表达LSC特异性标记波形蛋白、整合素β1、和p63、连接蛋白43，少数细胞出现K3/12弱阳性表达，RT-PCR技术检测发现hIDPSC与LSC一样出现间隙连接蛋白43及K12的表达。他们的研究结果显示，hIDPSC移入体内能分化成角膜上皮细胞，这些细胞能使角膜恢复清晰、平滑，整个角膜表面完全由移殖的hIDPSC组成。移植后第2周，角膜开始透明，到3个月逐步改善，此时HE染色研究表明，能形成类似正常的角膜上皮细胞，由此得出hIDPSC有能力分化为角膜上皮的结论。

1.2 向中胚层细胞分化

1.2.1 向成牙本质细胞分化 Iohara等［6］发现，骨形态发生蛋白-2在体外诱导DPSC，使其形态明显改变，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性显著提高，成牙本质细胞特异性的表型标记牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)呈阳性表达。Nakashima等［7］用电穿孔法将生长/分化因子-11基因导入DPSC使其分化，形成牙本质细胞样外观，并出现类似牙本质的修复。About等［8］发现，L-抗坏血酸、地塞米松、无机磷酸盐、维生素C和2-磷酸甘油钠可诱导DPSC产生牙本质样的矿化基质。

1.2.2 向成骨细胞分化 骨组织工程包括种子细胞、支架材料和生长因子等［9］。Pierdomenico 等［10］发现第3代人DPSC同BMSC一样，10 mmol/L β-甘油酸钠、0.2 mmol/L 抗坏血酸、10－8mmol/L 地塞米松诱导3～4周后，Von Kossa染色见钙化结节形成和ALP活性增强，显示了向成骨方向分化的特点。Wu等［11］的研究表明，毛囊真皮乳头干细胞与DPSC一样能实现成骨分化。Mendona等［12］在4个月的雄性NIS大鼠的颅顶区域制造5mm×8mm缺陷，左侧缺损处只提供胶原膜，右边提供胶原膜和hIDPSC，2个月后，右边区域处形成的骨质更成熟和致密，DPSC已用于骨组织工程种子细胞。

1.2.3 向软骨细胞分化 Zhang等［13］培养来自卫生研究所最初的牙髓细胞系［2］DPSC-NIH和冻存第3磨牙的25代DPSC，用5mmol/L的磷酸二氢钾、50 μg/ml的L-抗坏血酸和50 μg/ml庆大霉素等分别诱导3周后，发现两者形成的4个颗粒具有相似的表型，对颗粒中的细胞行组织学检测发现，人DPSCNIH形成的颗粒含有更多的细胞，中间的细胞大多呈圆形，由丰富的细胞外基质分隔，外围由一些纺锤形的细胞层形成。软骨细胞谱系阿尔辛蓝染色表明，两者形成结构中均有硫酸糖胺的高表达和Ⅱ型胶原，这种结构接近骨髓干细胞向软骨诱导分化形成的软骨结构。近年来，软骨细胞移植取得了可喜的成绩，但修复的软骨组织内细胞分子学特性尚未完全清楚［14］。DPSC向软骨细胞分化的深入研究有助于损伤修复特性的研究。

1.2.4 向脂肪细胞分化 Gronthos等［15］发现，泼尼松、0.5 mmol/L 异丁基甲基黄嘌呤、0.5 μmol/L氢化可的松，60 μmol/L消炎痛诱导DPSC 5周后，出现了油红O染色阳性的脂滴，利用RT-PCR方法发现，脂肪细胞特异性转录因子即过氧化物酶增生激活受体(peroxidase proliferator-activated recepiot γ2，PPARγ2)和脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)基因的表达。有学者用0.5 mmol/L异丁基甲基黄嘌呤、1 mmol/L地塞米松、10 mmol/L胰岛素、200 mmol/L吲哚美新、50mg/ml庆大霉素诱导人DPSC，免疫组化检测葡萄糖转运体4(glucose transporter 4，GLUT-4)，RT-PCR检测特异性标记 PPARγ2和GLUT-4的表达［13］，进一步证明 DPSC能向脂肪细胞分化。

1.2.5 向肌细胞分化 Laino等［16］研究证明，来自于脱落牙齿的CD34+/STRO－1+细胞，即DPSC与鼠肌C2C12细胞共同培养在嗜酸乳杆菌培养基中，可观察到肌管融合，进一步证明在适当的培养条件下，DPSC可向肌源性细胞分化。Zhang等［13］发现，0.1 mmol/L地塞米松、50 mmol/L氢化可的松、50 mg/ml庆大霉素可诱导DPSC出现成肌细胞早期标记生肌因子(myogenin，MyoD1)与后期标记主要组织相容性复合体(major histocompati-bility compler，MHC)的阳性表达，为DPSC的成肌分化研究提供更深入可靠的依据。

1.3 向内胚层细胞分化 Fonseca等［17］将人DPSC(46，XY)注射至5～8周的CD-1鼠的囊胚里，DPSC可以生存、增殖，形成滋养层细胞，分化为不同的细胞类型。当移植至培养老鼠的子宫中，这些囊胚可进行胚胎发生的过程，并形成人/鼠嵌合体，同时也保留人DPSC分化的特点，形成人体多种器官的细胞表现，例如脑、肝、肠和心脏。免疫荧光检测鼠胚胎的各部分，随着荧光的减少，抗hIDPSC抗体在脑、肝、肠和肌肉的嵌合体内出现高表达。肝和肠在胚胎来源上属内胚层，可认为hIDPSC在适当的条件下有向内胚层细胞分化的潜力。

2 DPSC分化的研究进展

2.1 分化方法 目前，对成体干细胞诱导分化方法主要分:①化学试剂(二甲基亚砜等)诱导，Lu等［18］认为，该法会使细胞出现毒性改变。②基因转染或修饰，但在真核细胞中表达率低、稳定性差。③细胞或组织共培养，但诱导条件控制相对困难。④细胞因子诱导。目前主要依靠 bFGF、转化生长因子β(transforming growht factor-β，TGF-β)、EGF 等，bFGF是一种具有广谱作用的多肽因子，可直接作用于其靶细胞(和血管内皮细胞等)上特异性受体，并通过促分裂效应使这些细胞发生分裂增殖，促进细胞增生［19］。研究表明，bFGF和 TGF-β联合作用，促DPSC向成牙本质样细胞分化作用显著增强［20］。细胞因子诱导可部分模拟体内环境，但各种因子的组合、时间、先后顺序的选择仍是DPSC分化需深入研究。

2.2 分化机制 关于成体干细胞可塑性的机制尚不十分明确，主要包括以下几种［21］:干细胞来源机制、去分化机制、细胞融合机制、一种组织中同时含有其他组织特定的细胞成分。Vassilopoulos等［22］通过对BMSCs的研究认为，成体组织干细胞横向分化是由于细胞自发融合。Tran等［23］对接受男性骨髓CD34+细胞移植的5例女性患者口腔上皮细胞进行了分析，提出细胞间的自发融合可能只是偶发事件，因此，横向分化现象发生的机制尚无定论。对DPSC与BMSC的分化能力研究有助于寻找干细胞的共同特点及性质，另外，牙髓组织来源广泛［6］，体积较小，随着诱导条件不断改进，研究人员终将会采用有效的方法获得足量的DPSC，并最终扩增出高效的分化细胞，逐渐解决种子细胞少、纯度低等问题，为分化机制的研究提供足够的成体干细胞来源。

2.3 表面标记 最近，Kerkis等［24］发现，DPSC能表达间质干细胞标记(SH2、SH3和SH4)和人类胚胎干细胞标记((OCT-4、SSEA-3和SSEA-4)。牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)与牙本质磷蛋白(dentin phosphoprotein，DPP)被认为是牙本质特异性蛋白，目前已证实 DSP、DPP是由单一基因编码的，被称为DSPP，是 DSP与 DPP的基因复合体，它们来源于同一转录本，DSPP可作为检测成牙本质细胞活性的生化指标［25］。但有报道DSPP在骨组织中也有少量表达［15］。Liu 等［26］发现，在 DPSC 向成牙本质细胞分化时，初始 Runx2、TGF-β相关基因、胶原代谢相关基因上调，ALP活性上升后均下降，而细胞外基质磷糖蛋白(matrix extracellular phosphogly coprotein，MEPE)是DPSC分化过程中唯一下降的标记物，故认为MEPE是矿化的抑制剂，在DPSC分化时下调，MEPE可作为分化的标记物。目前，DPSC表面特异性标记及分化后鉴定仍不完全明确，只有把这些问题解决，才能从细胞和分子水平上更深入的认识成体干细胞。

3 DPSC分化的应用及展望

3.1 牙齿及骨组织疾病的治疗 DPSC向成牙本质细胞和成骨分化，具有治疗牙体牙髓疾病、再生牙齿和骨组织修复的潜力。有学者诱导DPSC形成修复性牙本质保护暴露的牙髓，进行盖髓治疗［27］。目前，Perry等［28］正致力于利用实验室超低温保存DPSC进行牙齿再生的研究，一旦运用临床，则可能提高损伤牙体组织的生物活性，利于牙髓疾病愈合和组织再生。有学者证明，在适当的条件下，hIDPSC可进行成骨分化，并在动物手术60 d后颅骨缺损明显治愈［12］。DPSC有望作为种子细胞，恢复牙齿及骨组织的形态与功能将会进入一个全新的时代。

3.2 其他系统疾病的治疗 Huang等［29］培养恒河猴的DPSC发现其具有分化能力，将其植入实验鼠大脑中的海马区，发现其可以刺激神经胶质细胞的形成和生长。Agens等［3］将诱导后的DPSC移入胚胎发生2d的鸡胚中，脑荧光跟踪发现神经形态学特征，并表达特异性标记，说明DPSC可提供一个易得的干细胞来源，在神经系统疾病的治疗中有巨大的潜力。Monteiro等［5］也证明，DPSC可作为LSC替代来源，用于角膜重建，是角膜干细胞缺陷患者的巨大希望。以上DPSC体内移植后的细胞寿命需要进一步在动物体内进行观察，回植入人体内，时机、部位、数量等尚待探究。随着研究的深入，DPSC的分化也将有望应用于营养失调、软骨损伤、肌肉损伤及心脏的修复等机体多种组织器官损伤的修复治疗［30］。

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