内质网应激与膜性肾病

李静综述，夏正坤审校

0 引言

细胞应激涉及多种细胞器，细胞发生应激时首先启动ERS，它是线粒体应激和细胞核应激的共同通路。研究显示，定位于ER的网状蛋白质家族(Reticulon，RTN)成员之一的RTN 3在ERS时表达上调，过表达的RTN 3介导了真核细胞的凋亡信号转导通路。同时，RTN 3又通过激活Bcl-2的抗凋亡活性修复细胞［2］。ERS与氧化应激相互关联，UPR可聚集ER或线粒体依赖的簇，延长UPR可激活氧化应激，而氧化应激时产生大量的活性氧(reactive oxygen specie，ROS)也可激活ERS［3］。

引起ERS的原因众多，如细胞质中Ca2+紊乱、FK506结合蛋白(FK506 binding protein，FKBP)突变、缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤、蛋白尿、镉暴露、硒元素缺乏、泛素羧基末端水解酶-1抑制剂［4］等。这些因素干扰新生肽链的修饰与组装，引起ER内未折叠蛋白质的堆积，激活UPR信号转导通路。UPR可增强ER对异常蛋白质的处理能力，主要特征是上调ER伴侣蛋白GRP78、氧调节蛋白150(oxygen-regulated protein 150，ORP150)及钙网蛋白等。GRP78突变的小鼠，纯合子不能生存，杂合子的肾功能随年龄增长进行性下降，病理表现似肾小球硬化、肾小管萎缩和肾间质纤维化［5］。Richard等［6］研究表明，ERS还可上调T细胞死亡相关基因51(T-cell death-associated gene 51，TDAG51)的表达。过表达的TDAG51可不依赖于半胱天冬蛋白酶(caspase)介导的凋亡途径，在细胞凋亡之前即改变细胞形态，从而引起细胞失巢凋亡现象。依赖或不依赖于caspase的细胞凋亡途径都可加重ERS。ERS引起细胞凋亡最主要的原因是ER内Ca2+耗竭，而不是细胞内Ca2+升高或细胞外Ca2+内流引起的。研究报道，Bcl-2相互作用杀伤蛋白(Bcl-2 interacting killer，Bik)诱导人类肝癌Hep3B细胞凋亡与ER中Ca2+的耗竭有关［7］。

许多疾病都与ERS引起的细胞凋亡相关，如急性脑损伤［8］、肌营养不良［9］、癌症等。病毒利用宿主细胞的翻译机制来合成自己的病毒蛋白，从而增加ER的负担，上调了ER伴侣蛋白的表达［10］。肾病方面，对乙酰氨基酚及镉暴露引起的肾小管细胞损伤、蛋白尿引起的肾损害、MN等都与ERS损伤有关。现主要阐述ERS如何介导MN的发生发展。

1 足细胞和肾小管上皮细胞(human kideny cell，HKC)与ERS的关系

1.1 足细胞与ERS足细胞具有众多细胞器，这就提示了其高代谢、高分解的活性，表明足细胞对ERS具有高度敏感性。足细胞是终末分化细胞，足细胞损伤可导致肾小球硬化症和终末期肾衰竭，其对ERS的适应性反应非常重要。足细胞ER中megsin合成增加，导致megsin基因聚合和蛋白质处理系统泛滥，从而引发ERS。ER内聚集的错误折叠蛋白质与UPR和足细胞功能缺陷导致的严重蛋白尿有关。衣霉素和钙离子载体A23187通过削弱Ca2+依赖的分子伴侣，如钙网蛋白、钙联接蛋白的活性上调了megsin转基因鼠的离体足细胞中ER伴侣蛋白［6，11］。

Nephrin是肾小球滤过屏障中裂隙膜的重要成分，与蛋白尿的产生关系密切。被动型Heymann肾炎(passive Heymann nephritis，PHN)大鼠的蛋白尿与补体呈依赖关系，还与足细胞裂孔隔膜整体性、nephrin与肌动蛋白骨架的改变有关。nephrin部分从足细胞损伤的肌动蛋白上脱离，是与nephrin在足细胞足突进行性丧失及裂孔隔膜形态改变相伴行的，这表明nephrin与足细胞屏障功能的丧失有关［12］。足细胞可吞噬尿液中的清蛋白，清蛋白过负荷又可引起足细胞损伤诱发足细胞ERS。蛋白尿影响了裂隙膜蛋白质的生成，导致ER内非糖基化和未折叠的nephrin蛋白形成，提示足细胞ERS作为潜在因素在蛋白尿形成机制中可能与改变了nephrin蛋白的折叠和运输有关［13］。

肾组织中蛋白质更新率非常高，造成蛋白质合成负担的主要是膜固有蛋白。在受试者体内注入针对亮氨酸和苯丙氨酸的放射性示踪剂，评估肾每天蛋白质片段合成率约42%，而内脏和骨骼肌中分别是12%和1.5%。肾皮质层蛋白质每天更新约30%。新合成的蛋白质对于肾维持正常的功能非常重要。因此，ERS影响肾组织蛋白质更新时，也会损害肾功能。

1.2 HKC与ERSHKC对外界刺激很敏感。衣霉素通过扰乱HKC内蛋白质的糖基化诱导UPR，还可显著上调HKC中CAAT区/增强结合蛋白(C/EBP)同源蛋白(C/EBP homologus protein，CHOP)的表达，诱导HKC凋亡。CHOP基因敲除的小鼠能显著降低衣霉素介导的细胞凋亡，提示近端肾小管上皮细胞(proximaltubular cell，PTC)中CHOP的激活是由ERS介导的。小鼠体内注射衣霉素能诱导急性肾小管坏死，而ER内缺乏抗凋亡蛋白抑制物的细胞对衣霉素更加敏感［14］。多种慢性肾病均可损伤肾小管间质，导致大量蛋白尿，蛋白尿可激活caspase-12途径介导的细胞凋亡［15］。吴小玮等［16］研究显示，清蛋白超负荷可诱导HKC发生ERS，并通过上调促凋亡因子CHOP表达引起HKC中ER相关的细胞凋亡，这可能是蛋白尿引起肾小管间质病变的重要机制。持久的ERS逐渐促进了病理性ER反应诱导了PTC的凋亡，NS患者的PTC内GRP78和ORP150表达上调也无法阻断PTC的细胞凋亡。

2 ERS与MN

2.1 MN中ERS的Ca2+信号调节机制生理条件下，ER内Ca2+浓度约为400 μm［6］。ER膜上释放Ca2+的通道包括三磷酸肌醇(inositol 1，4，5-triphosphate，IP3)敏感的钙通道和Ryanodine受体(ryanodine receptor，RyR)Ca2+通道，钙泵回收Ca2+［11］。Ca2+可激活ER上Ca2+依赖Ca2+通道。细胞质中的Ca2+可与Ca2+结合蛋白结合，激活ER膜RyR释放Ca2+，或者增强IP3通道的敏感性，增加IP3诱导的Ca2+释放，该过程也称作钙诱发的钙释放(Ca2+-induced Ca2+-release，CICR)。Ca2+结合蛋白同时也构成了有效的Ca2+缓冲体系，使细胞内游离Ca2+约占细胞内Ca2+总体的1/100。

MN时，C5b-9聚集诱导了受体酪氨酸激酶的转录激活，酪氨酸激酶可激活磷脂酶C(phospholipase C，PLC)。PLC使磷脂酞肌醇的磷酸二脂键裂解而生成IP3和二酰甘油(diacylglycerol，DG)，IP3促使细胞内游离Ca2+升高，后者与DG一起激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，引起细胞的蛋白质合成。ER和线粒体上敏感的钙泵促使Ca2+分别进入ER和线粒体，缓解细胞质内高浓度Ca2+，但这种缓解是有限的。钙超载时线粒体中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide ade-nine dinucleotide，NAD)大幅增加，在NAD代谢过程中产生环腺苷二磷酸核糖(cyclicADP-ribose，cADPR)。一种观点认为，cADPR起媒介作用，cADPR激活RyR通道激发Ca2+释放，而细胞内Ca2+水平的轻微升高又可激活ADP环化酶，催化cADPR的合成，最终实现Ca2+诱导的CICR;另一种观点认为，cADPR是CICR过程或RyR活性的调节因子，cADPR致敏RyR，从而增强Ca2+内流诱发的CICR。cADPR通过与FKBP结合作用于RyR起作用。一方面，线粒体的Ca2+转运器摄取细胞内Ca2+，当线粒体对Ca2+的摄取量达到一定程度时，引起线粒体通透性转运孔的持续开放，最终导致线粒体功能障碍，使细胞质Ca2+升高［17］;另一方面，ERS中钙泵被细胞质中的Ca2+激活，使Ca2+进入ER。同时，Ca2+结合蛋白与Ca2+结合后作用于IP3受体通道与RyR通道，释放细胞质中更多的Ca2+。细胞质中高浓度的Ca2+可激活多种Ca2+依赖的降解酶，同时也激活了磷脂酶A2(Phospholipase A2，PLA2)和PLC，不仅使磷脂分解，影响了正常的生物膜磷脂分子层结构及其流动性，从而损伤细胞和细胞器膜，而且产生的游离脂肪酸、溶血磷脂亦有细胞毒性。PLA2通过水解磷脂Sn-2位脂酰键释放花生四稀酸(Arachidonic Acid，AA)，AA可开启细胞膜K+通道，导致膜去极化，当细胞膜过度去极化时，细胞膜上的Na+/Ca2+交换体将Ca2+运送至细胞内，进一步升高细胞质内的Ca2+浓度。AA还可促进氧化应激ROS的生成，引起细胞损害。细胞膜上Ca2+通道被激活后，一方面，细胞膜内侧的磷脂酰肌醇4，5二磷酸(phosphtidyli-nositol(4，5)-bisphosphate，PIP2)分解产生IP3和四磷酸肌醇(inositol 1，3，4，5-triphosphate，IP4)，并激活IP3受体，引起细胞内钙库的释放;另一方面，配体与受体的结合激活了腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)，产生大量的环化腺核苷一磷酸，激活蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)使通道蛋白发生磷酸化后开放，这类通道可被配体的竞争性抑制剂所阻［18］。

Ca2+结合蛋白的亚细胞定位可因信号调节而发生改变。增加Ca2+浓度可刺激某些Ca2+结合蛋白从细胞核向细胞质中输出，降低Ca2+浓度则使其由细胞质向细胞核中输出。细胞质中升高的Ca2+可与细胞质中过表达的Ca2+结合蛋白如钙调蛋白结合，调节许多酶的活性，甚至激活第3信使(如c-fos、c-jun等)，引起基因转录，诱导蛋白合成和细胞凋亡［19］。激活的PLC可分解PIP2生成IP3，后者水解PIP2产生IP3和DG。IP3可与ER的IP3受体结合，使ER储存的钙释放，Ca2+的内流也可以增强IP3受体的敏感性;DG则通过活化PKA，介导促分裂素原活化蛋白激酶和核因子-κB(nuclear factorκB，NF-κB)通道，其中NF-κB活化后，易位入细胞核结合位点调节转录，可能调控着与足细胞损伤有关的基因［20］;活化的PKA可磷酸化RyR通道，引起ER内Ca2+释放。脂溶性的DG生成后仍留在细胞膜内，它与Ca2+和膜磷脂中的磷脂酰丝氨酸共同将细胞质中的PKC结合于膜的内表面，并使之激活。细胞质内增加的Ca2+和激活的PKC，可进一步作用于下游的信号蛋白或功能蛋白。Ca2+依赖性蛋白酶的激活使细胞骨架系统破坏或重组，形成了细胞表面泡，表面泡通过扩张、破裂而损伤细胞，增加了滤过膜的通透性，使蛋白尿加重。过多的Ca2+也可由核孔扩散至细胞核，使核内Ca2+信号增强，激活Ca2+依赖性的核酸内切酶，造成了DNA的裂解，诱发细胞凋亡。上述整个过程中消耗了大量的ATP，最终ATP耗竭，细胞发生凋亡［21］。

2.2 ERS与补体MN中，补体攻击足细胞后，可能通过上调烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-氧化酶而使细胞内ROS的产生增加，ROS引起脂质超氧化反应，随后降解基膜胶原纤维Ⅳ，损伤足细胞，导致蛋白尿。研究表明，持续的蛋白尿最初上调了ER伴侣蛋白，保护PTC中正常的ER功能。Cybulsky等［22］报道，补体诱导的足细胞损伤与GRP78、GRP94的上调有关，这在伴有蛋白尿的PHN大鼠体内、外均可发现，提示ERS参与了MN的发病机制。实验前4d用衣霉素或毒胡萝卜素处理PHN大鼠会降低实验中大鼠的蛋白尿，说明ER伴侣蛋白诱导的保护性机制抵抗了补体介导的损伤。另一方面，补体通过PERK依赖的真核细胞翻译启始子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)的磷酸化，减少肾小球上皮细胞中蛋白质的合成是限制损伤的保护性机制。Cybulsky等［23］用体外I/R的实验模型证明，足细胞易受I/R损伤，这与PERK和eIF2α的磷酸化有关，提示UPR的分支PERK-eIF2α在足细胞缺血性损伤中具有抗凋亡作用。PERK限制了补体和I/R依赖的细胞毒性损伤，通过nephrin的mRNA的5′末端的转录调节限制I/R损伤。增加eIF2α磷酸化的PHN大鼠肾小球细胞，比PERK缺失的大鼠成纤维细胞对补体介导的细胞毒性敏感性增强，且PERK基因敲除的小鼠对ERS诱导剂更加敏感［24］。高剂量的补体导致细胞裂解，低剂量的补体尚不致死细胞。同时，补体攻击可能激活不同的通路，限制或促进细胞恢复。C5b-9聚集诱导了受体络氨酸激酶的转录激活，使细胞质中游离Ca2+聚集增加［22］，从而引发ERS。

2.3 ERS时UPR的双重作用ERS时，UPR可暂时降低其他蛋白质的生成，上调ER伴侣蛋白GRP、ORP150、Ca2+结合蛋白的表达。Ca2+结合蛋白和新生肽链都是Ca2+依赖性的。当ER中Ca2+耗竭，Ca2+结合蛋白可与细胞质中升高的Ca2+结合调节细胞内Ca2+浓度稳定，使与新生肽链结合的Ca2+较少，限制了新生肽链的合成。钙池耗竭可触发Ca2+重新内流，使钙池充盈，细胞功能恢复正常。强烈或持久的ERS时过表达Ca2+结合蛋白可磷酸化PERK、Ire-1，上调生长抑制DNA损伤基因153(GrowtharrestandDNAdamage-inducible 153，GADD153)等凋亡信号表达，活化ERS相关凋亡途径，引起细胞凋亡。

3 ERS与其他原发性肾小球疾病

最近，研究原发性肾小球疾病中ERS的作用是一个热点。一些研究显示，特别是伴有蛋白尿的肾小球疾病，能引起足细胞的进一步损伤。所有微小病变性肾病中，ER伴侣蛋白如GRP78、ORP150表达上调。微小病变性肾病、MN、局灶节段性肾小球硬化与GADD153的表达增加有关，MN、局灶节段性肾小球硬化中GRP78表达增加。MN、局灶节段性肾小球硬化、膜增生性肾小球肾炎和急进性肾小球肾炎比微小病变性肾病中的GRP78、GADD153表达增加［19］。Suchita等［21］报道，所有类型的原发性肾小球疾病中的肾损伤与ERS密切相关，ERS加速了增生性肾小球肾炎至肾衰竭的进展。ERS在不同基因缺陷的原发性肾小球疾病发展至肾功能衰竭中的作用还未完全阐明。

4 结语

ERS与MN的关系十分密切。对ER伴侣蛋白的测定将对MN的早期诊断和疗效判断产生巨大的影响，可对肾病采取新的干预和治疗措施，达到预防和治疗的目的。对ERS机制的研究具有广阔的应用前景，可对MN进行全面的评价，为临床和科研工作开辟一条新途径。ERS引起MN的许多机制仍未阐明，因此，仍需要对其进行进一步的研究，为临床治疗提供帮助。

［1］Preston AM，Gurisik E，Bartley C，et al.Reduced endolasmic reticulum(ER)-to-Golgi protein trafficking contributes to ER stress in lipotoxic mouse beta cells by promoting protein overload［J］.Diabetologia，2009，52(11):2369-2373.

［2］Wan QW，Kuang ES，Dong W，et al.Reticulon 3 mediates Bcl-2 accumulation in mitochondria in response to endoplasmic reticulum stress［J］.Apoptosis，2007，12(2):319-328.

［3］沈莉敏，吴晨光.氧化应激及其介导的细胞凋亡在糖尿病肾病中的作用［J］.医学研究生学报，2008，21(11):1222-1225.

［4］Tan YY，Zhou HY，Wang ZQ，et al.Endoplasmic reticulum stress contributes to the cell death induced by UCH-L1 inhibitor［J］.Mol Cell Biochem，2008，318(1/2):109-115.

［5］Mimura N，Hamada H，Kashio M，et al.Aberrant quality control in the endoplasmic reticulum impairs the biosynthesis of pulmonary surfactant in mice expressing mutant BiP［J］.Cell Death Differ，2007，14(8):1475-1485.

［6］Richard CA.The unfolded protein response in health and disease［J］.Antioxidants Redox Signaling，2009，11(9):2279-2287.

［7］Zhao XP，Wang L，Sun Y，et al.The endoplasmic reticulum(ER)-target protein Bik induces Hep3B cells apoptosis by the depletion of the ER Ca2+stores［J］.Mol Cell Biochem，2008，312(1/2):33-38.

［8］Venkata PN，Anchal G，Ram R.Endoplasmic reticulum stress plays critical role in brain damage after cerebral Ischemia/reperfusion in rats［J］.Neurotox Res，2010，17(2):189-202.

［9］Boito CA，Fanin M，Gavassini BF，et al.Biochemical and ultrastructural evidence of endoplasmic reticulum stress in LGMD2I［J］.Virchows Arch，2007，451(6):1047-1055.

［10］Su HL，Liao CL，Lin YL.Japanese encephalitis virus infection initiated endoplasmic reticulum stress and an un-folded protein response［J］.J Virol，2002，76(8):4162-4169.

［11］Reiko I，Masaomi N，Hiroshi O，et al.Involvement of endoplasmic reticulum(ER)stress in podocyte injury induced by excessive protein accumulation［J］.Kidney International，2005，68(8):2639-2650.

［12］张爱华.肾小球足细胞裂孔隔膜分子在蛋白尿发生中的作用［J］.医学研究生学报，2009，22(7):673-675.

［13］Fujii Y，Khoshnoodi J，Takenaka H，et al.The effect of dexamethasone on defective nephrin transport caused by ER stress:A potential mechanism for the therapeutic action of glucocorticoids in the acquired glomerular diseases［J］.Kidney Int，2006，69(8):1350-1359.

［14］Xu Q.Reed JC:Bax inhibitor-1，a mammalian apoptosis suppressor identified by functional screening in yeast［J］.Mol Cell，1998，1(3):337-346.

［15］Ohse T，Inagi R，Tanaka T，et al.Nangaku M:Albumin induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in renal proximal tubular cells［J］.Kidney Int，2006，70(8):1447-1455.

［16］Wu XW，He YN，Jing Y，et al.Albumin overload induces apoptosis in renal tubular epithelial cells through a CHOP-dependent pathway［J］.Mary Ann Libert，2010，14(1):61-73.

［17］Li PL，Tang WX，Valdivia HH，et al.cADP-ribose activates reconstituted ryanodine receptors from coronary arterial smooth muscle［J］.Am J Physiol，2001，280(1):H208-H215.

［18］Liang X，Xie H，Zhu PH，et al.Enhanced activity of inositol-1，4，5-trisphosphate receptors in atrial myocytes of atrial fibrillation patients［J］.Cardiology，2009，114(3):180-191.

［19］Miyazaki M，Fujikawa Y，Takita C，et al.Tacrolimus and cyclosporine a inhibit human osteoclast formation via targeting the calcineurin-dependent NFAT pathway and an activation pathway for c-Jun or MITF in rheumatoid arthritis［J］.Clin Rheumatol，2007，26(2):231-239.

［20］张蔷，孟凤琴，卜晖.内质网应激和肌萎缩侧索硬化［J］.医学研究生学报，2010，23(4):422-425.

［21］Markan S，Kohli HS，Joshi K，et al.Up regulation of the GRP-78 and GADD-153 and down regulation of Bcl-2 proteins in primary glomerular diseases:A possible involvement of the ER stress pathway in glomerulonephritis［J］.Mol Cell Biochem，2009，324(1-2):131-138.

［22］Cybulsky AV，Takano T，Papillon J，et al.Complement C5b-9 membrane attack complex increases expression of endoplasmic reticulum stress proteins in glomerular epithelial cells［J］.J Biol Chem，2002，277(41):41342-41351.

［23］Cybulsky AV，Takano T，Papillon J，et al.Role of the endoplasmic reticulum unfolded protein tesponse in glomerular epithelial cell injury［J］.J Biological Chemistry，2005，208(7):24396-24403.

［24］Bek MF，Bayer M，Müller B，et al.Expression and function of C/EBP homology protein(GADD153)in podocytes［J］.Am J Pathol，2006，168(1):20-32.