基于VNTR技术的食用红甜菜不育系的选育

时间：2024-07-28

张琛，罗成飞，程大友

(1.哈尔滨工业大学化工与化学学院; 2.哈尔滨师范大学)

0 前言

甜菜是重要的糖料作物，在我国东北、西北、华北具有较大的种植面积。甜菜杂种优势明显，但其花器相对较小，且无限开花，在实际生产中，使用大规模的人工去雄方法是不现实的，若杂交母本具有雄性不育性，不但可以免去人工去雄的麻烦，而且也不会对F1代产生干扰，保持性状稳定[2]，雄性不育植物提供了利用杂种优势重要的育种工具，也提供了研究杂交作物的重要材料。所以自Owen于1945年发现甜菜雄性不育性之后，甜菜杂交种利用便逐渐成为甜菜雨中的主流技术。目前大多数甜菜杂交品种，都是利用细胞质雄性不育(CMS)材料培育而成。迄今为止我国食用甜菜优势育种研究工作尚未开展，目前。

1 材料与方法

1.1 本研究所用实验品种为

来自一年生哈尔滨工业大学自育食用红甜菜品系“食甜一品红”。对照品种为已知育性的自育甜菜系DY5-O(保持系)和DY5-CMS(不育系)，其中CMS系是多次与O型系回交产生的较为稳定的CMS系。

1.2 主要试剂及配制

(1)甜菜幼叶DNA提取实验试剂：CTAB提取缓冲液：CTAB 4 g， NaCl 16.364 g， 0.5M EDTA 8 ml， 1MTris-HCl 20 ml，用70 ml ddH2O先进行溶解，再定容至200 ml，调节至pH8.0，灭菌，备用。巯基乙醇、氯仿、异戊醇、异丙醇、无水乙醇均为分析纯。

(2)琼脂糖凝胶电泳实验试剂：TAE电泳缓冲液50×：Tris碱242 g，冰醋酸57.1 mL，0.5 mol/L NaZEDTA 100 mL，加水至1 L调节至pH 8.0，使用时稀释为1×TAE。DL15000 Marker、DL2000 Marker(天根试剂公司)，EtBr染料(宝泰克生物科技有限公司)，上样缓冲液(北京鼎国昌盛公司)，琼脂糖(Gene Tech公司)。

(3)酶及其他试剂。

表1 酶及其他试剂

(4)花粉TTC染色液：准确称取0.5 g 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)，溶于水中，转移到容量瓶中定容至100 ml.pH7±0.5。配置成0.5%TTC溶液。

1.3 甜菜幼苗的培育及春化处理

1.3.1 甜菜幼苗的培育

首先选取需要进行育性鉴定的甜菜种子，甜菜种子外壳厚，一般播种前先在水中浸泡12-24小时，使其更容易出苗，采用纸筒育苗技术，将浸泡过的种子播种，浇适量的水，置于培养温室，大概一周以后，就可以长出幼苗，将其移入塑料盆，当甜菜长出4-6片真叶的时候，就可以对其进行春化处理。

1.3.2 甜菜的春化处理

将鉴定后被确认为不育系或保持系的甜菜母根在10月份甜菜收获后，将甜菜母根放入3～5℃的窖中保存，在第二年4月15日前后将保持系母根与不育系母根中一起进行采种。花期进行育性观察。

2 结果与分析

2.1 细胞质育性多态性

依据不同细胞质基因型的甜菜材料，其线粒体小卫星的多态性，对200株一年生甜菜的细胞质基因型进行鉴定，结果见表2。从表2可以看出，N1型细胞质98株，该类型约占49%；而S细胞质102株，占51%.说明该材料适合选育甜菜不育系和保持系。

表2 食用甜菜一品红细胞质及细胞核育性基因型分子检测结果

2.2 细胞核育性多态性

依据甜菜细胞核基因bvORF17-上游区域的多态性，对食用甜菜一品红品系的细胞核基因型的鉴定，发现食用甜菜一品红品系细胞核的T1T2基因位点3.3比例最高，达到了56%，其次是3.5型，达到了39%。而与经典遗传学中的保持系核基因型相同的‘xxzz’型隐形纯合基因型rf1rf1型选育出了11株。根据前人研究结果，我们指导该细胞核育性基因位点为T1T2。即T1T2基因位点为4.4型。

图1 不同细胞核类型所占比例

2.3 育性分子多态性

食甜一品红细胞质及细胞核的分子育性多态性分布情况如图2。Ow-4.4型占。该基因类型约占5.5%。这个比列与采用传统方法选育保持系的比列相近。

图2 不同细胞质与细胞核互作类型及比例

2.4 花期田间鉴定

对选育出Ow4,4型单株母根进行春化处理,春季栽植到田间进行花期育性鉴定。发现者11株的花药颜色多为褐色，个别白色。花药基本不开裂。几乎没有花粉粒，用TTC法染色也均无色，表现出较好的不育性。而与其栽植在一起的保持系植株的花药则表现出花药黄素，花粉粒饱满，用TTC法染色该花粉呈现红色，说明其花粉有活力育性很好。