3 种牧草种子萌发期耐盐性综合评价

王娅琳，魏 琳，李 娜，张 骞，常 涛，罗崇亮，赵 娜，徐世晓

（1.中国科学院西北高原生物研究所, 青海 西宁 810008；2.中国科学院大学, 北京 100049）

盐碱土是地球上广泛分布的一种土壤类型，对全球农业可持续发展存在巨大影响。我国盐碱土地资源广泛，各类盐渍土面积约有9.91 × 107hm2[1]。其中西北六省(区)盐碱地面积占全国的69.03%，是我国内陆盐碱土的集中分布区，土壤盐渍化问题突出[2]。且由于人类活动和气候变化的影响，盐碱土壤的面积还在不断增加和扩大。盐胁迫是盐碱地中植物重要的逆境因子之一，自然界中盐碱胁迫主要以NaCl、Na2SO4和NaHCO3等钠盐为主[3]。土壤盐渍化会使盐碱离子在土壤表层聚集，从而对植株细胞产生强烈的毒害，导致植物生长缓慢、生长矮小、产量低，严重制约农牧业经济发展[4-5]。且高浓度盐胁迫会通过离子毒害和植物组织缺水致使植物死亡[6]。同时，土壤盐渍化后土壤结构组成发生变化，出现土壤退化和水土流失等问题，导致植物更不易定植，进一步导致生态环境恶化[7]。因此盐碱地合理开发利用和改良是众多学者关注的热点。

选育耐盐碱植物是利用和改良盐碱地土地最科学的手段之一[8]。研究表明，草本植物是盐碱地生态植被重要组成成分，有些可作为先锋植物或建群种，对盐碱地生态修复有重要作用[9-10]。牧草作为西北地区重要的生产资料，是草食家畜的优良饲料[11]。且与多数农作物相比，牧草受土壤和水分的影响相对较小，有较强的抗逆能力，是发展耐盐植物、利用盐渍化土壤较好的材料[7,9-10]。同时有研究表明，种子萌发期是植物生活史中最脆弱的阶段，对盐胁迫的反应最敏感，可以直接影响牧草的生长速度和经济效益[12-14]。因此种子萌发期的耐盐能力大小对植物是否能适应盐碱环境起决定作用。

青海省受其特殊的地理位置和气候环境影响，是我国盐碱化土地分布的主要地区之一，农牧业生态系统十分脆弱[15]。且该省是我国重要的畜牧业生产基地，畜牧业生产是牧民赖以生存的经济来源[16]。对该区域盐碱地合理开发利用有利于提高民生福祉，维护生态稳定，减小天然草地放牧压力。因此选择适应该地区盐碱地生长的优良耐盐碱牧草尤为重要。本研究以青海省3 种乡土禾本科牧草垂穗披碱草(Elymus nutans)、老芒麦(E.sibiricus)和短芒披碱草(E.breviaristatus)为研究对象，分别研究其在NaCl 和Na2SO4两种盐胁迫下的耐盐能力，以期为筛选适合盐碱地生长的优良牧草品种提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试种子购于青海凯瑞公司，为商用种。所用钠盐为分析纯NaCl 和Na2SO4。挑选颗粒饱满、大小一致且无病虫害的垂穗披碱草、老芒麦和短芒披碱草种子，使用0.5% 高锰酸钾溶液消毒3 min 后，再用无菌蒸馏水冲洗干净，室温晾干后，保存于信封中备用，作为试验材料。

1.2 试验方法

分别设置50、100、150、200 和250 mmol·L-1的NaCl 盐溶液和40、80、120、160 和200 mmol·L-1的Na2SO4盐溶液，以蒸馏水作为对照(CK)。再将种子置于铺有两层滤纸、直径为9 cm 的培养皿中，每个培养皿中均匀放置50 粒种子。分别加入上述配比的不同浓度的NaCl 和Na2SO4盐溶液10 mL 至滤纸饱和，以后每天添加蒸馏水补充损失水分，使滤纸一直处于饱和状态。每个处理设置4 次重复，置于人工气候箱中。人工气候箱白天温度为25 ℃，夜晚温度为18 ℃，每天光照12 h，黑暗12 h，光照强度12 000 lx，湿度为60%[17]。每天记录萌发情况，以种子连续3 d 不再萌发为末次计数时间。种子发芽以胚根出现为标准[18]，以第3 天的发芽种子数计算发芽势，并在第10 天使用游标卡尺测量3 种牧草种子胚根长和胚芽长[19]。每个处理随机测量15 株，不足15 株的则全部测量。

1.3 测定指标

发芽率(germination rate, GR) = 各处理发芽种子数/供试种子数 × 100%；

发芽势(germination potential, GP) = 处理第3 天发芽种子数/供试种子数 × 100%； ∑

发芽指数(germination index，GI) = (Gt/Dt)。式中：Gt为相应天数种子的发芽数，Dt为萌发相应天数；

活力指数(vigor index, VI) = 发芽指数/胚芽长。

相对发芽率、相对发芽指数、相对活力指数、相对胚芽长及相对胚根长计算为处理组和对照组比值的百分数。相对发芽势为处理组第5 天发芽种子数和对照组发芽率比值的百分数。芽根比和相对盐害率计算公式：

芽根比 = 胚芽长/胚根长 × 100%；

相对盐害率 = (对照组发芽率 - 处理组发芽率)/对照组发芽率 × 100%[20]。

1.4 数据处理及耐受性综合评价

利用Excel 2010 对数据进行整理，SPSS 24.0 进行单因素方差和线性回归分析，GraphPad Prism 9.0作图。利用种子相对发芽率与相应盐溶液浓度建立回归关系，计算耐盐适宜浓度(相对发芽率为75%)、耐盐半致死浓度(相对发芽率为50%) 和耐盐极限浓度(相对发芽率为25%)[21]。同时，采用隶属函数法对不同盐浓度下3 种牧草种子的耐盐能力进行综合评价[22]，公式如下：

式中：j= 1, 2, 3,…,n。 µ(Xj)为各指标隶属函数值，Xj为某指标测定值，Xmin为某指标测定值的最小值，Xmax为某指标测定值的最大值。得到各项指标的隶属函数值后求其平均值。平均值越大说明耐盐性越大，平均值越小说明耐盐性越小。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对牧草种子发芽率和发芽势的影响

在两种盐胁迫处理下，3 种牧草种子发芽率和发芽势随盐浓度升高呈现不同程度的下降(图1)。与对照相比，垂穗披碱草和短芒披碱草盐胁迫下发芽率表现趋势相似。在小于100 mmol·L-1NaCl 和80 mmol·L-1Na2SO4处理下，发芽率均没有明显下降(P＞ 0.05)，大于100 mmol·L-1NaCl 和80 mmol·L-1Na2SO4处理下，发芽率显著降低(P＜ 0.05)。在250 mmol·L-1NaCl 和200 mmol·L-1Na2SO4浓度时，垂穗披碱草发芽率下降至37.00% 和11.00%，短芒披碱草发芽率下降至15.50% 和20.00%。老芒麦种子在40 mmol·L-1Na2SO4和50 mmol·L-1NaCl 处理下，发芽率无明显变化，在150 mmol·L-1NaCl 和80 mmol·L-1Na2SO4处理下，发芽率显著下降(P＜ 0.05)。在250 mmol·L-1NaCl 和200 mmol·L-1Na2SO4浓度时，种子发芽率下降至18.50%和7.00%。3 种牧草种子发芽势随盐浓度升高呈现明显下降趋势。其中，在250 mmol·L-1NaCl 和200 mmol·L-1Na2SO4浓度时，垂穗披碱草发芽势下降至7.50% 和1.00%，短芒披碱草发芽势下降至2.00% 和7.00%，老芒麦发芽势下降至5.00%和0。

图1 Na2SO4 和NaCl 盐溶液对3 种牧草发芽率和发芽势的影响Figure 1 Germination rate and potential of three herbage species under different concentration of Na2SO4 and NaCl

2.2 盐胁迫对牧草种子发芽指数和活力指数的影响

种子发芽指数和活力指数是衡量种子活力的重要指标。3 种牧草种子发芽指数和活力指数随NaCl 和Na2SO4盐浓度增加表现出不同的下降趋势(图2)。与 对 照 相 比，在250 mmol·L-1NaCl 和200 mmol·L-1Na2SO4浓度下，垂穗披碱草发芽指数降低至对照值的26.50%和8.15%；短芒披碱草发芽指数降低至20.12% 和13.22%；老芒麦发芽指数降低至13.10%和4.59%。3 种种子活力指数在200 mmol·L-1Na2SO4和250 mmol·L-1NaCl 浓度时均下降为0。

图2 Na2SO4 和NaCl 盐溶液对3 种牧草发芽指数和活力指数的影响Figure 2 Germination and vitality indices of three herbage species under different concentrations of Na2SO4 and NaCl

2.3 盐胁迫对牧草种子胚芽和胚根及芽根比的影响

3 种牧草种子胚芽长和胚根长均随两种盐浓度增高而逐渐减小(表1)。垂穗披碱草在160 mmol·L-1Na2SO4和250 mmol·L-1NaCl 时胚芽不再长出；200 mmol·L-1Na2SO4和250 mmol·L-1NaCl 时，胚根长下降至对照的2.16% 和4.92%。短芒披碱草在200 mmol·L-1NaCl 和160 mmol·L-1Na2SO4时 胚 芽 不 再长出；200 mmol·L-1Na2SO4时，胚根也失去活力，250 mmol·L-1NaCl 时胚根下降至对照的2.00%。老芒 麦 在120 mmol·L-1Na2SO4和200 mmol·L-1NaCl时胚芽不再长出；胚根在200 mmol·L-1Na2SO4时不再长出，250 mmol·L-1NaCl 时根长下降至对照的1.99%。且随盐浓度增加，3 种牧草芽根比均呈现先增加后下降的趋势，说明盐胁迫对3 种牧草种子的毒害先作用于胚根生长后先作用于胚芽生长。

表1 NaCl 和Na2SO4 处理对3 种牧草种子胚芽、胚根和芽根比的影响Table 1 Effects of NaCl and Na2SO4 treatments on seed germ, radicle, and shoot root ratio of three herbage species

2.4 盐胁迫对牧草种子相对盐害率的影响

NaCl 和Na2SO4对3 种牧草种子盐害率随盐浓度增加呈上升趋势(图3)。在Na2SO4胁迫下，3 种牧草种子相对盐害率大小为老芒麦 ＞ 垂穗披碱草 ＞短芒披碱草。其中，垂穗披碱草种子在80～120 mmol·L-1时相对盐害率增加最大，短芒披碱草则在160～200 mmol·L-1时相对盐害率增加最大，老芒麦在40～80 mmol·L-1时相对盐害率增加最大。250 mmol·L-1NaCl 胁迫下，3 种牧草种子相对盐害率大小为短芒披碱草 ＞ 老芒麦 ＞ 垂穗披碱草。其中，垂穗披碱草和老芒麦种子在150～200 mmol·L-1时相对盐害率增加最大，短芒披碱草则在200～250 mmol·L-1时相对盐害率增加最大。

图3 NaCl 和Na2SO4 溶液对3 种牧草种子相对盐害率影响Figure 3 Effects of NaCl and Na2SO4 solutions on relative salt damage rates of three herbage seeds

根据盐浓度与相对发芽率间的关系建立回归直线方程式(表2)。计算得到，垂穗披碱草对Na2SO4的耐盐适宜浓度、半致死浓度和临界浓度分别为48.93、94.80 和140.66 mmol·L-1，对NaCl 的耐盐适宜浓度、半致死浓度和临界浓度分别为135.15、207.59 和280.03 mmol·L-1。短芒披碱草对Na2SO4的耐盐适宜浓度、半致死浓度和临界浓度分别为110.45、157.96和205.46 mmol·L-1，对NaCl 的耐盐适宜浓度、半致死浓度和临界浓度分别为139.11、195.56和252.02 mmol·L-1。老芒麦对Na2SO4的耐盐适宜浓度、半致死浓度和临界浓度分别为55.26、105.24和155.21 mmol·L-1，对NaCl 的耐盐适宜浓度、半致死浓度和临界浓度分别为118.89、177.18 和235.46 mmol·L-1。

表2 3 种牧草种子对NaCl 和Na2SO4 溶液的耐受浓度Table 2 Tolerated concentrations of NaCl and Na2SO4 solutions for three herbage seeds

2.5 盐胁迫下3 种牧草种子耐盐能力综合评价

使用隶属函数法计算NaCl 和Na2SO4胁迫下3 种牧草的8 个萌发指标，进而计算各隶属函数的平均值，结果(表3) 显示，Na2SO4胁迫下3 种牧草耐盐排名为短芒披碱草 ＞ 垂穗披碱草 ＞ 老芒麦；NaCl 胁迫下，3 种牧草耐盐排名为垂穗披碱草 ＞ 短芒披碱草 ＞ 老芒麦。3 种牧草中垂穗披碱草和短芒披碱草综合耐盐指数相对较高。

表3 3 种牧草各指标隶属函数值和耐盐性综合评价Table 3 Membership function values and comprehensive evaluation of salt tolerance in three herbage species

3 讨论

发芽率和发芽势是评价种子发芽能力的重要指标，能评价植物对盐胁迫的耐受能力[21]。发芽率能在一定程度上体现耐盐性的差异，耐盐性越高发芽率越高。发芽势反映了种子一定时间内的萌发速度，发芽势高低可反映盐胁迫对种子萌发速度的影响[23]。本研究中，3 种牧草种子发芽率和发芽势均随盐浓度增高呈现下降趋势，与李京蓉等[17]结果一致，说明盐浓度过高抑制种子萌发，降低了3 种牧草的发芽率和发芽势。研究表明盐胁迫达到种子耐盐临界浓度时，会导致植物产生离子毒害和渗透压失衡，一方面细胞外溶液环境的渗透压会抑制种子对水分的汲取和利用，干扰细胞的正常生命活动，另一方面无机盐离子进入细胞，改变细胞膜的渗透调节，进一步扰乱细胞内部的代谢活动，使种子呼吸作用无法正常进行，从而导致种子发芽率和发芽势大幅降低，甚至死亡[24-25]。本研究中在200 mmol·L-1Na2SO4和250 mmol·L-1NaCl 时，种子发芽率和发芽势处于较低状态，说明此浓度时种子已受盐离子毒害，无法完成正常生命活动。

发芽指数和活力指数反映种子的萌发速度、整齐度和幼苗生长潜力，同等盐胁迫下，发芽指数和活力指数越高，耐盐性越好[26]。在本研究中，200 mmol·L-1Na2SO4和250 mmol·L-1NaCl 时，3 种牧草种子活力指数均已为0，虽部分种子萌发了胚根，但均未长出胚芽。可能原因是种子在萌发吸水过程中，种子内的可水溶物质含量较高，种皮渗透势降低，有利于从环境中吸水，短时间内启动了生理活动，使种子萌发的标志物胚根出现，但由于胁迫作用抑制其生长，从而导致活力指数显著降低[27]。且本研究中，Na2SO4盐胁迫对3 种种子的盐胁迫能力大于NaCl 盐胁迫，原因可能为Na2SO4盐溶液的离子浓度高于NaCl 盐溶液，造成了更大的渗透胁迫，进一步抑制了种子萌发生长[28-29]。

胚芽、胚根和芽根比能反映植物对盐胁迫的响应，是植物幼苗感受到盐胁迫后最直观的变化。本研究中，与对照相比，幼苗胚芽和胚根在盐胁迫下均表现出明显下降趋势，与季波等[26]研究结果相似，说明盐胁迫抑制了3 种牧草胚根、胚芽的伸长。且从胚芽长度看，垂穗披碱草胚芽在250 mmol·L-1NaCl 时不再长出，短芒披碱草和老芒麦胚芽200 mmol·L-1NaCl 时不再长出，说明垂穗披碱草对NaCl盐胁迫的耐受性较高。老芒麦胚芽在120 mmol·L-1Na2SO4时不再长出，说明老芒麦对Na2SO4盐胁迫最敏感。且3 种种子芽根比随盐胁迫浓度增加均呈现先增加后减小趋势。这说明在较低盐胁迫下，植物胚根受到毒害大于胚芽，生长速度更慢，后随盐浓度增加，种子活力下降较大，植物仅能长出较短胚根，不能再抽出胚芽，这与胡卉芳等[30]研究结果相同。同时，罗小燕等[31]研究也表明盐胁迫主要通过阻碍植物根系吸收水分的方式影响植物生长发育，与本研究结果一致。

利用单一指标鉴定植物的抗盐性强弱具有片面性，需采用多指标相结合的方法对植物的耐盐性进行综合评价。本研究中采用8 个指标进行耐盐碱能力综合评价，通过隶属函数和主成分权重相结合法计算植物耐盐碱能力，发现Na2SO4胁迫下3 种植物耐盐碱能力由强至弱依次为短芒披碱草 ＞ 垂穗披碱草 ＞ 老芒麦，NaCl 胁迫下3 种植物耐盐碱能力为垂穗披碱草 ＞ 短芒披碱草 ＞ 老芒麦。通过对植物半致死浓度的计算也发现NaCl 胁迫下垂穗披碱草半致死浓度最高，为207.59 mmol·L-1，Na2SO4胁迫下短芒披碱草半致死浓度最高，为157.96 mmol·L-1。结果说明，NaCl 胁迫下垂穗披碱草较其他牧草耐盐碱水平高，Na2SO4胁迫下短芒披碱草耐盐碱水平高。值得注意的是，垂穗披碱草对NaCl 胁迫的耐受度较高，但对Na2SO4胁迫耐受度较低，这可能跟植物自身对离子的敏感度有关[32]。短芒披碱草在两种盐胁迫下较稳定，且均表现出较高的耐盐性，是较为理想的盐碱地种植候选牧草。

4 结论

通过对3 种牧草两种盐胁迫下发芽指标的分析发现，3 种牧草发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均随盐浓度增加而降低，但由于种子特性表现出不同的下降速度。随盐浓度增加，3 种牧草胚芽和胚根生长受到显著抑制，芽根比呈现先增加后降低的趋势，说明植物胚根对盐胁迫更为敏感。通过耐盐度评价计算，垂穗披碱草对NaCl 胁迫的耐受度最高，而短芒披碱草对两种盐胁迫有较稳定的表现和较高的耐受能力，可作为盐碱地种植的候选牧草。