30 份草地早熟禾苗期耐盐性综合评价

夏华美，曹志坚，于铭玥，李 珍，聂春雅，张鹏阳，郭 欢

（1.西北农林科技大学草业与草原学院, 陕西 杨凌 712100；2.银川市农村经济发展服务中心, 宁夏 银川 753000）

我国盐碱化土壤分布范围很广，主要在北方及滨海地区，总面积超过3.6 × 107hm2，为全国可利用面积的5%左右[1]，并且由于长期高频灌溉、化肥的不合理施用和生态环境恶化等原因，在全球范围内土壤盐碱化日趋严重，已经成为主要环境问题[2]。盐碱化土壤有机质含量少，土壤结构差，难以被利用[3]。盐碱环境会降低植物种子的发芽率，还会造成渗透胁迫、生理干旱和离子毒害等一系列负面效应，影响植物水分利用、激素调节和光合作用等生理生化过程，造成植物生长受抑，发育迟缓[4-7]。大量盐碱地的存在缩小了耕地面积，造成生态环境持续恶化，限制了农林经济发展和城乡绿化水平提升[8-9]。草坪作为城市园林绿化建设的重要组成部分，其灌溉需求量较大，而北方干旱半干旱地区降水量少、蒸发强烈，长期灌溉导致土壤表层含盐量增加，土壤次生盐渍化加重，草坪在盐渍环境下易出现秃斑、春季返青晚、秋季早衰、生长不良等现象，大大降低了草坪的外观质量和坪用价值，严重影响草坪的大面积建植与管理[10-11]。

草地早熟禾(Poa pratensis)是目前世界上应用最广的冷季型草坪草之一，为根茎疏丛型多年生禾草，匍匐根状茎发达，繁殖力强，能够快速成坪；质地纤细柔软，耐践踏；具极强的抗寒性，适应性广泛[12]。草地早熟禾成坪后外观平整，青绿期长，再生能力突出，生长年限长，具有较高的观赏价值和实用价值，在我国许多地区如西藏、青海、甘肃、山西、陕西、内蒙古、新疆和四川等地区均有其野生种质资源分布[13]。鉴于上述优良特性，草地早熟禾被大量用于我国北方地区城市和景观绿化建设。然而，草地早熟禾的耐盐性在冷季型草坪草中相对较差[14]。

研究发现，同种植物不同品种的植株其耐盐性存在显著差异，耐盐性的鉴定评价对筛选和培育耐盐品种具有重要意义，也是耐盐机制研究的基础[8,15-17]。植物的苗期是盐分敏感期，现有的植物耐盐性研究大多都是在苗期进行[18-19]。于卓等[20]在对5 种草地早熟禾进行耐盐性研究时发现，草地早熟禾幼苗细胞膜忍受盐浓度的极限范围在0.8%～1.6% (137～274 mmol·L-1NaCl)。Bae 等[21]采 用 砂 培 法 以400 mmol·L-1NaCl 的盐浓度处理草地早熟禾植株15 d，研究其对盐胁迫的生理响应。刘一明和王兆龙[14]采用水培法对多个草地早熟禾品种进行盐胁迫(300 mmol·L-1NaCl)处理20 d，以分析比较其耐盐性。叶绿素含量可以反映植物的光合能力、氮素营养状况和生长发育状况[22-23]，是植物环境胁迫研究中的重要指标[24]。同时草坪的色泽是评价草坪质量优劣的重要指标，其与叶绿素含量也密切相关[25]。叶片相对含水量能够直接反映植物组织的水分状况，是指示植物在逆境下保水能力和生理功能强弱的重要指标[26]。株高、生物量和分蘖数能够直观反映植物的生长状况和禾本科植物的繁殖能力，也被广泛应用于植物耐盐性评价[27-28]。刘艳等[29]在研究水稻(Oryza sativa)耐盐性时发现，地上部鲜重和植株整体鲜重与盐害等级极显著负相关，植株干重和苗长与盐害等级负相关。刘一明等[30]在研究4 种暖季型草坪植物的耐盐阈值时，选用草坪质量、生长量、叶片相对含水量、光化学效率和叶绿素指数等指标。综上所述，为了引进和培育对北方盐渍化环境具高耐受力的草地早熟禾品种，本研究选取400 mmol·L-1的NaCl 浓度对常见的30 种商用草地早熟禾品种进行盐胁迫处理，同时选取了直观、测量便捷且被广泛认可的10 个生长和生理指标，即株高、分蘖数、各组织生物量、叶绿素含量和叶片相对含水量等对苗期草地早熟禾的耐盐性进行分析评价。

1 材料与方法

1.1 试验材料

30 份草地早熟禾供试品种(表1)由西安百绿景观设计有限责任公司、北京克劳沃生态科技有限公司和北京正道生态科技有限公司提供。

表1 供试草地早熟禾品种及其来源Table 1 Kentucky bluegrass varieties and their sources

1.2 试验设计

挑选籽粒饱满、大小均一的草地早熟禾种子若干进行砂培撒播方式种植，每个品种种植6 个培养盆(长7 cm × 宽7 cm × 高8 cm)，用蒸馏水喷水培养10 d，待种子基本萌发后进行间苗，每个培养盆中保留10 株长势良好且一致的幼苗，于昼/夜温度25 ℃/22 ℃、光照时长16 h·d-1、空气湿度约50%、光照强度约800 μmol·(m2·s)-1的条件下培养。用1/2 Hoagland营养液培养幼苗5 周后开始盐胁迫处理(即种子萌发且间苗后幼苗生长35 d 开始进行盐处理)，此时大部分草地早熟禾的单株分蘖数达到最大，植株生长旺盛[31]。处理前修剪各品种植株高度使其株高保持一致(约10 cm)，盐处理组幼苗用添加400 mmol·L-1NaCl 的1/2 Hoagland 营养液进行浇灌(处理开始以50、100、200、300 和400 mmol·L-1的NaCl 浓度依次递增，各浓度间隔时间24 h，终浓度增加至400 mmol·L-1时开始计时)，对照组用1/2 Hoagland 营养液正常浇灌，盐处理期间每隔2 d 更换所有处理液，同时随机调整植株在培养架上的位置以保证各植株培养条件一致。观察不同处理下各品种之间的生长表型，处理14 d 后取样进行相关指标测定。本试验重复3 次。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 株高和分蘖数

采用直接测量法，用直尺随机测量各处理植株的单株株高(从茎基部到植株顶部的自然高度)，测定5 个重复。从不同培养盆中随机轻柔拔出5 株幼苗，目测计数法统计植株基部茎节上长出的分枝个数，即为分蘖数。

1.3.2 植株生物量

将整株植株从培养盆中小心取出(取样时每个培养盆中的10 株幼苗同时取出，随机3 株幼苗作为一个重复)，用蒸馏水将其根部冲洗干净，吸水纸擦干组织表面水分，从茎基部将植株分为地上部和根，称量地上部和根样品的鲜重，称量完后放入纸袋。将所有样品在105 ℃烘箱杀青10 min 后调整烘箱温度在80 ℃烘干72 h 至恒重。待样品冷却至室温后称量干重。各处理取5 个重复，每个重复含3 株幼苗。

1.3.3 叶绿素含量测定

称取3 株植株相同部位叶片约0.2 g，用丙酮乙醇混合液(体积比为2 ∶ 1)浸泡，置于暗环境下24 h，然后用分光光度计分别在645 和663 nm 处比色。计算得出叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素含量。计算公式如下：叶绿素a (Chl a) = 12.70 ×OD663- 2.69 ×OD645；叶 绿 素b (Chl b) = 22.88 ×OD645- 4.68 ×OD663；总叶绿素(Total Chl) = 20.20 ×OD645+ 8.02 ×OD663。每个处理5 个重复。

1.3.4 叶片相对含水量测定

相对含水量采用烘干法进行测定。取3 株植株相同部位叶片约0.5 g，称取鲜重(FW)，置入盛有蒸馏水的试管中浸泡过夜，使叶片充分吸水达到饱和状态。取出叶片，吸水纸擦干表面水分，称取叶片饱和重(RW)。之后将样品置于80 ℃烘箱烘干至恒重后称取叶片干重(DW)。叶片相对含水量(RWC)计算公式：RWC= (FW-DW)/(RW-DW) × 100%。每个处理5 个重复。

1.4 数据分析

为了减少不同品种间的固有差异，将各品种盐处理和对照条件下的性状测定值转换为性状相对值用于后续计算分析，性状相对值 =Xs/Xc，式中：Xs 和Xc 分别表示盐处理和对照条件下性状测定值的平均值。

使用Excel 2016 软件进行试验原始数据的统计和运算，指标降低百分率 = (Xc -Xs)/Xc × 100%；通过SPSS 22.0 软件对各生理指标的性状相对值进行主成分分析。对各指标数据采用“T 检验”方法分析差异显著性(P＜ 0.05)，柱状图用平均值±标准误表示测定结果。利用主成分分析法[32]对30 份草地早熟禾耐盐性进行综合评价。在因子分析前，首先进行KMO (Kaiser-Meyer-Olkin)检验和Bartlett’s球形检验，KMO 检验是通过比较各个变量之间简单相关系数和偏相关系数的大小判断变量间的相关性，Bartlett’s 球形检验是检验各个变量是否各自独立，二者均是用于判断原始变量是否适于作因子分析。当KMO 检验系数 ＞ 0.6，Bartlett’s 球形检验的显著性概率(Sig) ＜ 0.05 时，适合进行因子分析。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对草地早熟禾株高和分蘖的影响

400 mmol·L-1NaCl 处理下，30 种草地早熟禾的株高均显著低于对照条件(P＜ 0.05) (图1A)，其中‘Prafin’(1 号)、‘肯塔基’(13 号)、‘蓝精灵’(14 号)和‘探险家’(22 号)的株高降低幅度较小，分别下降了35.45%、32.62%、35.31%和36.71% (图1A、表2)，‘飞达’(7 号)、‘协奏曲’(25 号)、‘摇滚明星’(26 号)和‘支点’(30 号)的株高较对照下降52%以上(图1A、表2)。多数品种的分蘖不受盐胁迫的明显抑制，其中盐处理下，‘黑杰克’(10 号)、‘肯塔基’(13 号) 和‘蓝仙儿’(16 号) 的分蘖数较对照下降幅度在5% 以内(图1B、表2)；‘Prafin’(1 号)、‘TBH’(2 号)、‘洁妮2 代’(12号)、‘蓝 精 灵’(14 号)、‘满 月’(19 号)、‘启 动’(20 号)、‘ 午 夜’(24 号)、‘ 优 异’(28 号)、‘ 月 光’(29 号) 和‘支 点’(30 号) 10 个 品 种 的 分 蘖 数 较 对 照显著降低(P＜ 0.05) (图1B)，下降幅度均在25%以上(表2)，其中‘支点’(30 号)的下降幅度最大，达到66.67% (表2)。

图1 盐胁迫下30 份草地早熟禾的株高和分蘖数Figure 1 Plant height and tiller number of 30 Poa pratensis seedlings under salt stress

表2 盐胁迫下30 份草地早熟禾各生长生理指标下降百分率Table 2 Decline rates in growth and physiological indicators for 30 Poa pratensis seedlings under salt stress

2.2 盐胁迫对草地早熟禾生物量的影响

与对照相比，盐胁迫下除‘肯塔基’(13 号)品种外(仅比对照降低18.14%)，其余草地早熟禾品种的地上部鲜重均显著降低(P＜ 0.05)，(图2A、表2)，其中‘蓝精灵’(14 号)和‘蓝之梦’(17 号)下降幅度较大，分别达71.66% 和71.80%，而‘富春’(9 号) 和‘协奏曲’(25 号)下降幅度较小(在35%以内)。各品种地上部干重呈现不同程度的降低，其中‘蓝精灵’(14 号)、‘蓝之梦’(17 号) 和‘优异’(28 号) 相比于对照降低幅度较大(图2B)，分别下降52.09%、53.29%和52.14% (表2)。‘费加罗’(8 号)、‘火山’(11 号)、‘肯塔基’(13 号)、‘蓝仙儿’(16 号)、‘探险家’(22 号)、‘午夜’(24 号)、‘协奏曲’(25 号)、‘摇滚明星’(26 号)、‘优美’(27 号)和‘支点’(30 号) 10 个品种的地上部干重与对照相比差异不显著(P ＞0.05) (图2B)，下降了10%左右(表2)。

图2 盐胁迫下30 份草地早熟禾的地上部鲜重和干重Figure 2 Shoot fresh weight and shoot dry weight of 30 Poa pratensis seedlings under salt stress

400 mmol·L-1NaCl 处理后，草地早熟禾的根组织生物量变化趋势与地上部生物量类似，大多数品种的根鲜重较对照条件显著降低(P＜ 0.05)，(图3A)，其 中‘飞 达’(7 号)、‘蓝 精 灵’(14 号)、‘蓝 之 梦’(17 号)和‘优异’(28 号)的下降幅度超过60% (表2)；‘富春’(9 号)、‘肯塔基’(13 号) 和‘乐土’(18 号) 的根鲜重与对照相比差异较小，分别下降13.54%、11.78%和5.08% 。盐胁迫下，‘Prafin’(1号)、‘TBH’(2号)、‘飞达’(7 号)、‘费加罗’(8 号)、‘蓝精灵’(14 号)、‘蓝神’(15 号)、‘蓝之梦’(17 号)、‘满月’(19 号)、‘启动’(20 号)、‘如意’(21 号)、‘优美’(27 号)和‘优异’(28 号)这12 个品种的根干重显著下降，下降幅度均在24%以上(P＜ 0.05)(图3B、表2)，而盐处理对其余品种的根干重无明显影响。

图3 盐胁迫下30 份草地早熟禾的根鲜重和干重Figure 3 Root fresh weight and root dry weight of 30 Poa pratensis seedlings under salt stress

2.3 盐胁迫对草地早熟禾叶绿素含量和叶片相对含水量的影响

盐胁迫下，30 份草地早熟禾的叶绿素a 含量均较对照显著降低(P＜ 0.05)(图4A)，其中‘肯塔基’(13 号)和‘探险家’(22 号)的叶绿素a 含量较对照下降低于20% (表2)。400 mmol·L-1NaCl 处理对‘洁妮2 代’(12 号)、‘肯塔基’(13 号)、‘乐土’(18 号) 和‘优美’(27 号) 4 个品种的叶绿素b 含量没有显著影响，其余品种的叶绿素b 含量均较对照显著下降(图4B)。盐处理下，除‘肯塔基’(13 号)、‘乐土’(18 号)和‘探险家’(22 号)相比对照条件总叶绿素含量下降在10%以内，其余品种的总叶绿素含量均较对照显著降低(图4C)。此外，草地早熟禾各品种的叶片相对含水量均受盐胁迫的影响显著降低，其中，盐处理后，‘富春’(9 号)、‘蓝精灵’(14 号)、‘满月’(19 号) 和‘优异’(28 号) 品种的叶片相对含水量降低幅度较大，均比对照下降超过22% (图4D、表2)。

图4 盐胁迫下30 份草地早熟禾的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和叶片含水量Figure 4 Chlorophyll a, Chlorophyll b, total chlorophyll, and leaf relative water content of 30 Poa pratensis seedlings under salt stress

2.4 盐胁迫下草地早熟禾种质材料各指标的主成分分析

主成分分析能够以少数几个代表性较好的综合指标代替原始的多个指标，这些相互独立的综合指标能够反映原始指标绝大部分的信息[33]。对盐胁迫下30 种草地早熟禾各生理指标的性状相对值进行主成分分析，提出因子时采用的旋转方式为最大方差法。KMO 统计量值大于0.6，且Bartlett’s 球形检验也显示指标间并非相互独立，表明变量间有相关性，适合做因子分析。分析结果显示，前3 个因子的特征值均大于1，累积方差贡献率为71.33%，表明提取这3 个因子能够较全面地反映草地早熟禾幼苗的耐盐性(表3)。第1 主成分特征值为3.918，方差贡献率为39.18% (表3)，其中地上部鲜重、地上部干重、根鲜重、根干重的因子载荷量大于 0.7，该主成分反映的是草地早熟禾的生物量(表4)；第2 主成分特征值为1.941，解释了总变异的19.41% (表3)，其中叶绿素a 和叶绿素总含量的因子载荷量较大(大于0.6)，该主成分反映植株的光合能力(表4)。第3 主成分特征值为1.274，方差贡献率为12.75% (表3)，其中株高的因子载荷量大于0.7，可反映植株的生长状态(表4)。

表3 初始特征值和提取的主成分贡献率Table 3 Initial eigenvalues and extracted principal component contribution rate

表4 因子载荷矩阵Table 4 Component matrix

通过提取的主成分因子载荷矩阵(表4) 计算3 个主成分特征向量(U)及主成分因子得分(F1、F2、F3)。特征向量(U)为各主成分因子载荷量(A)除以主成分特征值(λ)的算术平方根(即Ui=Ai/)，然后将标准化的原始数据(X˜)代入相应主成分的解析表达式计算各品种的3 个主成分因子得分(F1、F2、F3)，具体计算公式如下：

式中：U为各主成分中10 指标对应的特征向量，为各品种10 个指标的标准化数据。最终以各主成分因子的方差贡献率对主成分得分进行加权，F=b1F1+b2F2+b3F3。各品种主成分综合得分如表5 所示，得分越高，表明耐盐性越强。30 份草地早熟禾的得分范围在-1.38～2.31，综合得分最高的品种为‘肯塔基’(2.31)，得分最低的为‘满月’(-1.38)。根据综合得分，筛选出耐盐性较强的品种有‘肯塔基’‘乐土’‘探险家’‘月光’和‘优美’，耐盐性较弱的品种有‘蓝精灵’‘飞达’‘优异’‘蓝之梦’和‘满月’。

3 讨论与结论

盐胁迫是限制植物生长的重要非生物因子，盐胁迫会导致大部分植物的生物量、叶绿素含量和叶片相对含水量明显下降[34-35]。本研究显示，400 mmol·L-1NaCl 下，草地早熟禾外观表现为矮小萎蔫和叶片发黄症状；植株株高、分蘖数、生物量、叶绿素含量和叶片相对含水量均呈现不同程度的下降趋势(图1-图4)，这与高羊茅(Festuca arundinacea)、结缕草(Zoysia japonica)、水稻、茶菊(Chrysanthemummorifolium)等其他植物的研究结果一致[8,36-38]。盐胁迫对各品种株高和分蘖的影响主要表现在，盐处理后植株株高均显著下降，其中‘肯塔基’下降幅度最小，下降了32.62% (图1A、表2)；而盐处理只对草地早熟禾少数品种(10 个)的分蘖能力有显著影响，如‘蓝精灵’‘优异’和‘满月’等(图1B)。盐处理后草地早熟禾各品种(‘肯塔基’除外)地上部鲜重均显著降低(图2A)，‘肯塔基’‘蓝仙儿’和‘探险家’的地上部干重下降幅度较低，均在10% 左右(图2B、表2)；而‘蓝之梦’地上部生物量受盐胁迫的影响最大，地上部鲜重和干重分别下降71.80%和53.29% (表2)。研究表明，盐胁迫下植物的根系最先接受到信号并做出适应性响应，反映根系生长状况的指标与植物的耐盐性极显著相关[39-40]。本研究中，盐胁迫下草地早熟禾品种‘飞达’‘蓝精灵’‘蓝之梦’和‘优异’的根鲜重较对照下降超过60%，而‘肯塔基’和‘乐土’仅分别下降11.78%和5.08% (图3A、表2)，表明‘肯塔基’和‘乐土’具有更发达的根系以适应盐渍环境。不同品种间叶绿素含量分析结果显示，‘优美’‘探险家’‘乐土’和‘肯塔基’在盐处理下能够维持较高的叶绿素含量，其叶绿素含量比对照下降20%左右(图4)，而‘蓝精灵’叶绿素b 含量下降高达71.40% (图4B)，‘满月’的总叶绿素含量下降幅度最大，为55.70%(图4C)。此外，草地早熟禾各品种的叶片相对含水量受盐胁迫的影响均显著降低(图4D)，其中‘蓝精灵’‘满月’和‘优异’的叶片相对含水量较对照下降幅度较大，在22%以上(表2)。综上所述，耐盐能力较强的草地早熟禾品种，如‘肯塔基’和‘乐土’等能够在保证植株一定分蘖能力的基础上，维持较高的叶绿素含量和体内水分平衡，进而提高盐处理下植株的光合能力，增加各组织生物量积累以适应盐渍环境。而耐盐性弱的品种，如‘蓝精灵’‘满月’等在盐胁迫后较难维持体内叶绿素含量和水分平衡，导致植株生长发育严重受抑。

在多指标综合评价方法中，主成分分析法是常用且可靠的抗逆性评价方法[41]。本研究通过主成分分析将10 个性状指标归为3 个主成分，累计贡献率达71.33% (表3、表4)，综合得分结果显示，在盐处理下能够保持较高生物量、叶绿素含量和叶片含水量的品种有‘肯塔基’‘探险家’‘乐土’和‘优美’等，它们的综合排序靠前，具有较强的耐盐性；而‘支点’‘蓝精灵’‘飞达’‘优异’‘蓝之梦’和‘满月’排序靠后，这些品种在盐处理后生物量、叶绿素含量及叶片含水量较对照下降幅度较大，对盐胁迫更为敏感(表5)，表明综合得分排序结果与幼苗实际生长表型和生理指标分析结果基本一致。于卓等[20]研究发现草地早熟禾品种‘肯塔基’幼苗的耐盐能力强于适应性广泛的内蒙古当地野生驯化栽培品种‘大青山’。王婧等[18]研究发现草地早熟禾‘优美’和‘肯塔基’品种苗期的耐盐性较强，这与本研究得出的结果一致。

植物耐盐性是十分复杂的生理生化过程，植物会通过渗透调节、提高抗氧化酶活力、改变光合途径和诱导相关基因表达等多种手段提高其耐盐性[42]。研究发现，草地早熟禾‘优美’和‘肯塔基’可以通过提升体内脯氨酸含量，清除聚积的活性氧来提高耐盐性[16,20]，这可能是具有较强耐盐性的‘优美’和‘肯塔基’品种适应盐胁迫的重要策略。大量研究表明，质膜透性、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量和K+/Na+等指标与植物的耐盐性密切相关[43-44]。本研究后续可进一步分析这些生理生化指标，探究草地早熟禾抗性品种的耐盐生理机制及其与盐敏感品种的耐盐机制差异。本研究发现，草地早熟禾的耐盐性与其根系生长状况关系密切，后续研究可参考刘梦霜等[38]的研究方法，对草地早熟禾进行水培，以最大程度保持根系的完整形态，减少试验过程中根系损伤。

综合本研究分析结果，筛选出的耐盐性强的草地早熟禾品种有‘肯塔基’‘乐土’‘探险家’‘月光’和‘优美’；而品种‘蓝精灵’‘飞达’‘优异’‘蓝之梦’和‘满月’的耐盐性较弱，不适宜盐渍化土壤建植。本研究的试验材料品种多，市场流通大，研究结果对于盐碱地区建植草地早熟禾草坪和栽培草地时的选种具有较大的参考意义。后续可针对‘肯塔基’‘探险家’和‘优美’等耐盐能力较强的品种展开进一步研究，探究其耐盐内在机制，挖掘耐盐关键基因，为耐盐草地草熟禾新品种的选育奠定基础。