饲草型高羊茅引进品种的表型变异分析

伍文丹，雷 雄，赵文达，杨晓鹏，熊 毅，熊艳丽，张新全，马 啸

（1. 四川农业大学动物科技学院，四川 成都 611130；2. 四川省草业技术研究推广中心，四川 成都 610041；3. 四川省草原科学研究院，四川 成都 611731）

高羊茅(Festuca arundinacea)，又称苇状羊茅，是世界温带地区广泛生长的主要冷季型多年生草本植物[1]。其自然种群分布在欧洲、非洲西北部、北美洲、西亚和中亚的温带地区[2]。相对于多年生黑麦草等其他冷季型禾草，它具有生长旺盛、对土壤和气候的广泛适应性、对氮肥敏感、高度耐牧性、以及生长季利用时间长等特点[3]。在全球气候变暖的情况下，高羊茅相对较强的耐旱性使得它在温带和亚热带之间的过渡性气候带(包括我国长江中下游地区)中的栽培需求大大增加[3-5]。按其功能划分，高羊茅一般分为饲草型和草坪型两类，其中饲草型高羊茅的显著特点是叶片粗糙、直立生长和植株高大[6]，可用作长期放牧草地的优良牧草，能与其他禾草或豆科牧草混播，可作为牛、马、羊饲养及作为其他反刍家畜的维持口粮。高羊茅是异花授粉的异源六倍体(2n = 6x =42)，基因组组成为PPG1G1G2G2，具有高度的自交不亲和性[7]。这些特点使得育种工作通常集中于发展优良综合品种或改良异质群体，这两种群体都由遗传上具有许多共同特征的独特个体组成[7]。20世纪40年代以来，在北美和欧洲地区，500多个高羊茅品种得以选育和释放[8]，其中牧草型高羊茅约有130个[3]。

对种质资源进行详细的形态和农艺性状描述是对其有效利用的前提。由于所有的羊茅属物种具有高度异花授粉和自交不亲和的特点，在群体内和群体中的个体之间表现出高度的遗传异质性。因此，一般利用增加群体中有利等位基因频率的方法来进行品种选育，包括对生态型或育种群体的表型混合选择法及综合品种选育法[3]。综合品种通常使用半同胞或全同胞家系进行后代测试后从亲本无性系中构建[9]。由于牧草产量、种子产量、牧草品质等重要的农艺性状均为数量遗传位点控制，故而表型评价对于设计有效的选择育种程序非常重要[9]。利用这些表型数据可以进一步获得关于遗传变异、遗传力、基因型和环境相互、性状相关性和遗传进度预测的信息[7]。Veronesi和Falcinelli[10]利用多元分析法基于12个表型性状数据描述了意大利高羊茅自然群体间的丰富的表型变异。Chtourou-Ghorbel等[11]发现突尼斯高羊茅自然群体的表型多样性受到基因型和环境互作的强烈影响。Majidi等[7]研究了高羊茅半同胞家系的遗传变异、遗传力及遗传相关性，发现株高、干草产量具有较高的狭义遗传力。

目前我国登记利用的高羊茅饲草型品种中，引进品种占据绝大多数，因此对高羊茅优良种质资源的引进、评价和筛选，对于选育拥有自主知识产权的优质饲用型高羊茅品种有重大促进作用。本研究将采用简单相关分析、方差分析、主成分分析、聚类分析对引种自美国植物种质资源库(National Plant Germplasm System of USDA, NPGS)的19份饲草型高羊茅品种的株高、旗叶长宽、茎粗等14个表型性状进行考察，以期为亚热带中高海拔地区筛选优质品种提供支持。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于四川省雅安市四川农业大学基地，地 理 坐 标 38°08′ N， 103°14′ E， 海 拔 620 m，属北亚热带湿润季风气候区。年均气温16.2 ℃，最冷月(1月)到最热月(7月)之间的均温变化为6.1到25.3 ℃，全年最高气温37.7 ℃，年降水量1 774.4 mm，年蒸发量1 011.2 mm，相对湿度79%，日照时数1 039.6 h，无霜期304 d，＞ 10 ℃年积温5 231 ℃·d。试验地系白垩灌口组紫色砂页岩风化的堆积物形成的紫色土，土质黏重，pH 6.5。全量养分N、P、K的含量分别为0.14%、0.25%、2.66%，速效养分分别为 83.1、25.5、97.2 mg·kg-1。

1.2 试验材料和田间小区

供试高羊茅品种种子来源于美国农业部植物种质库(NPGS)，共19份饲草型高羊茅品种(表1)。每份高羊茅品种取50粒种子进行发芽，发芽方法为，每个品种的单一种子被放在一层滤纸上，滤纸用水浸泡在培养皿中。培养皿在20 ℃下置于黑暗中，直到发芽。发芽后将培养皿转移到光照培养箱中，设置光周期 14 h，光照强度 300 μmol·(m2·s)-1，光周期温度22 ℃，暗周期10 h，暗周期温度18 ℃。2015年9月，将在光照培养箱里发芽并培养两周的参试高羊茅植株通过穴播移栽至田间小区。田间小区采取随机区组设计，每份高羊茅品种种植3个小区,小区面积为1.2 m × 1 m，每小区12株，株行距为30 cm，试验期间不施肥，适时进行除杂和浇水。

表1 供试高羊茅高羊茅品种Table 1 Tall fescue cultivars used in this study

1.3 测定指标及方法

2016 - 2017年的春季，在抽穗开花期和成熟期主要观察测定了14个形态和农艺指标(表2)。测定时，每份品种的3个重复小区各选取5个单株，合计15株，每个性状同一单株选取相近分蘖枝重复测量3次。各性状均为两年度的品种内单株的均值。

1.4 数据分析

获得性状指标数据后，使用DPS 14.5软件[12]计算各个性状指标的平均值(mean)、最大值(max.)、最小值(min.)和变异系数(CV，CV = S/，式中，S为标准差，为单个性状的平均值)。利用性状指标数据基于Pearson相关系数检测对各性状间的相关性和显著性进行评估；综合各个性状进行主成分分析(principal component analysis, PCA)：将各性状的平均值经标准化(减去平均值再除以标准差)后用于创建相关系数矩阵，再用于计算和提取能够代表供试样本大部分变异的主成分(特征向量)；利用NTSYS 2.21软件进行基于样本间欧氏距离的UPGMA聚类分析[13]，根据UPGMA聚类树矩阵计算计算其协表征矩阵(cophenetic matrix)，然后再利用Genlex 6.5软件进行Mantel检验，以评估聚类结果与GS矩阵的符合度[14]。

2 结果与讨论

2.1 表型性状的描述性分析

在植物育种中，对种质资源各个表型性状进行变异系数统计评价是至关重要一步[15-16]，在育种工作中，各种质资源形态性状的变异系数越高，种质资源群体的变异潜力就越大，也越能筛选出优良品种。Lou等[17]选取31份美国高羊茅品种形态性状综合评价表明，美国高羊茅种质资源形态性状的变异较高。本研究对19份饲草型高羊茅品种的14个性状指标的统计分析结果显示(表3)，各性状指标在品种间变异系数的变化范围为9.1%～46.9%，所有性状变异系数平均值为23.45%，变异系数依次为节数 ＜ 株高 ＜ 茎粗 ＜ 小穗数 ＜ 千粒重 ＜花序长 ＜ 旗叶长 ＜ 小花数 ＜ 节间长 ＜ 旗叶宽 ＜ 单株干重 ＜ 分蘖数 ＜ 营养枝数 ＜ 单株鲜重。一般认为，当样本间有明显差异时，性状变异系数 ＞ 10%[18]，而14个性状指标变异系数中只有节数小于10%，说明参试品种间各个性状差异明显，类型丰富，有利于高羊茅品种的比较和筛选。此外，参试品种的单株鲜重(CV = 46.9%)和营养枝(CV = 45.3%)的变异系数最大，表明参试品种在产草量性状上具有很高潜力，有利于选择高产品种及用于高产育种的亲本材料[19]。

表2 形态性状及测量标准Table 2 Morphological and agronomic traits and measurement standards

表3 参试高羊茅品种表型性状数据统计Table 3 Descriptive statistics for 14 phenotypic traits of studied tall fescue cultivars

植株形态性状指标间往往具有复杂相关性，了解表型性状指标间的相关性有助于评价高羊茅种质[20]。利用Pearson系数对19份引进饲草型高羊茅品种的表型性状进行相关分析，发现各性状间存在显著相关性(表4)。其中，株高与旗叶长(r =0.645, P ＜ 0.01)、单株干重 (r = 0.578, P ＜ 0.01)极显著正相关，与单株鲜重(r = 0.551, P ＜ 0.05)显著正相关，而与茎粗和小花数则负相关，这在其他禾本科类植物，如水稻（Oryza sativa）[21]、多花黑麦草（Lolium multiflorum）[19]上有相似结果。旗叶长与单株干重 (r = 0.524, P ＜ 0.05)和节间长 (r = 0.468, P ＜0.01)显著正相关，与茎粗较为明显的负相关。旗叶宽与茎粗(r = 0.625, P ＜ 0.01)、小穗数(r = 0.771,P ＜ 0.01)极显著正相关，与营养枝数(r = 0.499, P ＜0.05)显著正相关。营养枝数与分蘖数(r = 0.934, P ＜ 0.01)极显著正相关。茎粗与小穗数(r = 0.550, P ＜0.05)和小花数(r = 0.646, P ＜ 0.01)分别显著正相关与极显著正相关。结果表明，植株越高大，旗叶越长，产草量性状就表现越好；植株茎秆越粗壮，旗叶越宽，生殖性状就表现越好，同时，株高与茎粗呈现一定程度的负相关（r = -0.345），这与Chtourou-Ghorbel等[11]对35份突尼斯地区高羊茅进行农艺评价的结果相似。

2.2 主成分分析与聚类分析

利用主成分分析法分析19份参试品种14个性状指标并提取主成分，提取标准为特征值大于1[22]，结果表明前5个主成分累计贡献率已达到82.7%(表5)，因此测定的14个性状指标的总信息量可以由这5个主成分概括。其中，第1个主要成分的贡献率为27.44%，特征值为3.84，表现明显的性状是旗叶宽、小穗数和单株干重；第3个主要成分的贡献率为23.11%，特征值为3.24，表现明显的性状是株高、旗叶长和单株干重；第3个主成分的贡献率为15.26%，特征值为2.14，表现明显的性状是节数、花序长和小花数；第4个主要成分的贡献率为8.71%，特征值为1.22，表现明显的性状是千粒重和节数；第5个主成分的贡献率为8.17%，特征值为1.14，表现明显的性状是节间长、花序长和千粒重。5个主成分综合来看，代表和反映了参试品种的植株高矮、叶片大小、花序结构、产草量及种子质量等特征，是造成参试品种形态变异的主要因素，可以利用这5个主成分对19份参试品种进行综合评价。此外，第一主成分和第二主成分的二维图(图1)反映了参试品种的分组模式，本研究发现19份参试品种除Fawn和Kenwell外可以被分成两类。

表4 各表型性状间的简单相关分析Table 4 Bivariate correlation analysis of 14 phenotypic traits

表5 主成分分析结果汇总Table 5 Summary of principal component analysis for studied tall fescue cultivars

应用类平均法UPGMA将19份引进饲草型高羊茅的14个形态性状指标进行聚类分析，并建立聚类树状图。结果表明，19份品种间欧氏遗传距离变幅为19.9～137.6，在欧氏遗传距离取平均值为65.9时，19个参试品种除Fawn和Kenwell外可被分为两大类，分类结果与主成分分析得到的分类结果一致(图1)：类群Ⅰ包含Kenhy、Safe、Forager、Penngrazer、Nanryo、Martin、Willamet、Missouri-96、Johnstone、Cattleclub共10种品种，类群Ⅱ包含Barcel、Alta、 Kentucky31、 Autriumph、 Carefree、 Cajun、Maximize共7个种品种。基于聚类树状图矩阵计算的协表征矩阵(Cophenetic matrix)与基于14个形态指标计算的欧式距离矩阵之间的Mantel检验显示两者显著正相关(r2= 0.490 9, P = 0.01)，表明聚类结果与欧氏距离矩阵的符合度较高(图2)。

对类群Ⅰ和类群Ⅱ品种的各性状指标进行t检验(表6)，结果发现只有营养枝数、分蘖数和小花数差异极显著(P ＜ 0.01)。其中，类群Ⅱ品种的营养枝数和分蘖数性状的表现远优于类群Ⅰ品种，表明类群Ⅱ品种无性扩繁的能力优于类群Ⅰ品种；小花数属于植物生殖性状，在小花数性状的表现上，类群Ⅰ品种表现更好，表明类群Ⅰ品种可能在种子繁育方面更有优势。品种Fawn和Kenwell在聚类结果中各自独立出来，Fawn品种的特点为叶片较小，分蘖数、小穗数、小花数以及千粒重均低，表明它产草量小，种子繁育能力也低，在西南农区表现较差；品种Kenwell叶片狭长，分蘖旺盛，小穗数与小花数均比较高，但千粒重表现差。

图1 基于表型性状的高羊茅品种的主成分得分二维图Figure 1 Principal component score plot of 19 tall fescue cultivars by 14 phenotypic descriptors

图2 基于表型性状的参试高羊茅品种的聚类分析Figure 2 Clustering Analysis of studied tall fescue cultivars based on phenotypic traits

表6 利用t检验比较参试高羊茅品种两个类群的性状值Table 6 Comparison of the character values of two groups of tall festuca cultivars by T-test

两个类群间的部分性状的显著差异说明聚类结果可以一定程度上反映参试品种的特点及表型差异，但是大部分性状在两个类群间并无显著差异，这与表型数量性状数量较少、易受环境影响有关，加上人工选育绝大多数为直立、高产等方向上的选择育种，导致供试品种的形态差异较小。另外，高羊茅为典型的异花授粉植物且自交不亲和[7]，各品种群体间遗传相似性较高也可能是导致表型差异较小的原因。因此，一方面需要继续扩大参评参试种质数量，进行多年多点的评价，另一方面还要结合生理代谢、分子标记等方面的研究，对饲草型高羊茅种质资源进行更全面精准的筛选鉴定和育种潜力评估。

3 结论

丰富的牧草种质资源是选育优质牧草的重要条件。本研究中，参试的19份引进饲草型高羊茅品种在部分表型性状上表现出丰富的变异，有利于新品种的筛选与培育。遗传变异最大的两个性状指标分别是单株鲜重与营养枝，可以在饲草型高羊茅选育中考虑将这两者作为主要目的性状进行筛选评价。参试品种可分为两大类，Ⅱ类群内10份品种具有分蘖旺盛、营养枝数多等特点，Ⅰ类群内7份品种小花数更多，则更适用于种子生产。