盐生草Actin基因片段的克隆及表达

马艳红，徐先良，汪军成，任盼荣，杨 柯，2，孟亚雄，2，李葆春，3，马小乐，2，王化俊，2

（1．甘肃省干旱生境作物学重点实验室／甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃 兰州730070；2．甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州730070；3．甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州730070）

肌动蛋白（Actin）普遍存在于生物细胞中，是生物体中微丝的一个单节结构，而微丝则是细胞骨架三大组成结构之一，参与细胞内许多很重要的生理过程，比如细胞分裂、细胞分化、细胞运动、内吞作用、成核作用、信号转导等［1］，在植物的生长发育方面具有至关重要的作用。由于肌动蛋白基因是一种古老保守的蛋白，并且表达水平受环境影响很小，因而常被看作生物细胞生理过程中的管家基因，在基因表达中被广泛用作分子内标［2－4］。

盐生草（Halogeton glomer atus）为黎科盐生草属一年生草本盐生植物，在我国分布于甘肃西部、青海、新疆及西藏等地区，生于海拔400～1 700 m 的山脚，在戈壁滩、沙丘荒地、砾质荒漠、河滩及河谷阶地等地带的干旱山坡间歇性河床等地方生长比较旺盛［5－6］，地上多分枝的茎具有很强的防风固沙、保持水土、耐盐和抗旱能力，是一种典型的盐生植物［7］。当前，植物盐胁迫响应机制研究的不断深入，生物技术发展迅速以及转基因技术不断成熟，为通过生物技术手段提高植物耐盐性和改良盐碱土奠定了基础。盐生植物由于长期生长在盐渍化土壤中，在其漫长的进化过程中形成了一系列生理生化适应机制，具有与非盐生植物截然不同的信号转导途径和调控机制［8－9］。研究发现盐生草在500 mmol·L－1NaCl胁迫下生长状况良好，盐胁迫下可将盐分贮存于叶片组织细胞中［10］。发掘盐生草本身所蕴含的、丰富的耐盐基因资源，来改善和提高当前作物的抗盐性，对培育耐盐作物新品种具有重要意义。对盐生草Actin基因的克隆，无疑对其耐盐相关基因的表达模式研究起到重要的参考作用。

截至目前，在甜菜（Beta vul garis）、碱蓬（Suaeda salsa）、梭梭（Hal oxylon a mmodendr on）等盐生植物中克隆到了Actin 基因片段，然而关于盐生草Actin基因的研究还未见报道。所以，本研究拟以盐生草叶片为材料，用RT－PCR 方法克隆得到盐生草Actin 基因片段，并对其在根、茎、叶器官中的表达量进行了验证。

1 材料与方法

1．1 试验材料

试验所用盐生草（Hal ogeton glomer atus）种子采自甘肃省会宁县河滩盐碱地。Plant RNAkit（R6827－01）植物组织RNA 提取试剂盒购自Omega公司；p MD19－T 快速连接试剂盒均购自Ta Ka Ra（大连）有限公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；DNA Marker购自天根生化科技有限公司；IPTG、X－Gal、DMF、Amp及β－巯基乙醇等均为进口分析纯级试剂；样品测序由华大基因研究院完成。

1．2 试验方法

1．2．1 总RNA 提取 根据Omega植物总RNA提取试剂盒操作说明提取RNA。利用Nanophoto meter Pearl微量紫外分光光度计测定RNA 样品230、260及280 n m 的光吸收值，确定RNA 纯度及浓度。

1．2．2 RT－PCR 扩增 用Ta Ka Ra Pri meScriptⅡ1st strand c DNA 合成试剂盒反转录得到c DNA 第一链。根据Gen Bank中已登录的碱蓬（Suaeda salsa），海滨碱蓬（S．mariti ma），盐节木（Halocnemu m strobil aceum）的保守序列设计上下游引物，序列如下：

上游：5′GTGGTCGTACAACWGGTATTGTG 3′，下游：5′GAHCCTCCAATCCAGACACTG 3′。PCR 反应体系：dd H2O 17．3μL，10×Ex Taq Buffer（Mg2＋Plus）2．5μL，d NTP Mixture（各2．5 mmol·L－1）2μL，上游1μL，下游1μL，c DNA 1 μL，Ex Taq酶（5 U·L－1）0．2μL。

PCR 反应条件：94℃预变性3 min，94 ℃变性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，32个循环，最后72℃延伸6 min。PCR 扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行检测。

1．2．3 PCR 产物纯化回收 扩增产物均使用Ta Ka Ra Mini BEST DNA 胶回收试剂盒回收。

1．2．4 阳性克隆的筛选与鉴定 参照Ta Ka Ra p MD19－T 载体克隆试剂盒说明书，在PCR 管中建立连接体系，并且连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，随之挑取白色菌落于Amp／LB 液体培养基中，同时挑取一个蓝色菌落作为对照，37 ℃，236 rp m 振荡培养过夜。第2天菌液PCR，将扩增出目的条带的菌液分装保存，并且送华大基因研究院测序。

1．2．5 序列分析 序列的比对和分析分别运用NCBI网站和DNAman软件完成。

1．2．6 Actin 基因不同器官的表达特性分析 用荧光定量RT－PCR 来分析盐生草Actin基因在不同器官的相对表达水平，具体做法如下：将8周龄大小的盐生草植株用含200 mmol·L－1Na Cl的Hoagland营养液处理后取根、茎、叶用于q PCR 分析，每天更换一次营养液。总RNA 的提取及c DNA 第一链的合成同1．2．1 及1．2．2。根据荧光定量PCR引物设计原则设计引物，引物由ABI公司Pri mer Express Soft ware v 2．0 软 件 设 计，序 列 上 游：5′－TGTTCTCAGTGGTGGTACAA－3′， 下 游：5′－GTGCCACCACCTTAATCTTC－3′。反 应 在ABI 7300实时荧光定量PCR 仪上进行，采用SYBR Green 染料法进行相对荧光定量检测。反应体系：2×PCR mix （QIAGEN）10μL，Pri mer 上 游（10 μmol·L－1）1μL，下游（10μM）1μL，c DNA 1μL，dd H2O 7μL。反应条件：95 ℃预变性2 min，94 ℃变性10 s，59 ℃退火10 s，72 ℃延伸40 s，40个循环，最后72 ℃延伸10 min。试验数据分析采用ABI 7300实时荧光定量PCR系统软件和Excel 2003软件。

2 结果与分析

2．1 盐生草叶片总RNA 的提取

以盐生草叶片为材料提取的总RNA 经凝胶电泳检测其完整性且其亮度比基本呈（1．5～2）∶1，可以看出28S r RNA 和18S r RNA 的条带清晰（图1），为了确定其值，用微量紫外分光光度计测定样品在230、260及280 n m 处的光吸收值。结果显示其A260／A230为1．8～2．0，A260／A280在1．9～2．1左右，表明RNA 纯度较高，可以进行下一步试验。

图1 盐生草总RNA凝胶电泳Fig．1 Total RNA of Halogeton glomer atus

2．2 RT－PCR扩增

以反转录得到的c DNA 为模板，用特异性引物上游和下游进行扩增。扩增产物通过凝胶电泳检测，在600 bp左右有一亮带（图2），符合预期产物大小。将目的片段纯化回收后连接T 载体，并转化DH5α感受态细胞，将鉴定为阳性克隆的菌液送测。测序结果表明该片段大小为598 bp，与RT－PCR 结果一致，表明已克隆得到该基因的核心片段。

图2 Actin核心片段扩增产物Fig．2 The core fr agment PCR pr oduct of Actin

2．3 序列测定结果与分析

图3 盐生草Actin基因片段的核苷酸序列及推测的氨基酸序列Fig．3 The nucleic acid sequence and deduced amino acid sequence of Actin gene fragment from Halogeton glomeratus

图4 盐生草Actin基因氨基酸序列与其他植物氨基酸序列的同源性比较Fig．4 Halogeton glomer atus Actin and other plants amino acid sequences homology comparison

测序得到的盐生草Actin 基因序列为598 bp，编码198个氨基酸（图3）。运用DNAman软件将随机挑选的几种植物与盐生草进行氨基酸多重性比较（图4），比较结果显示盐生草的保守氨基酸达176个，非保守氨基酸仅有22个，这表明克隆的盐生草Actin基因处于高度保守区域。将此序列在Gen－Bank中进行Blast比对，结果表明，Actin 基因编码的氨基酸与所选取的这几种植物基因编码的氨基酸具有较高的同源性（图5）。其中与同科的碱蓬（Suaeda salsa）、甜菜（Beta vul garis）的同源性均达到94%。与不同科植物拟南芥（Ar abidopsis thaliana）、牵牛花（Pharbitis nil）、白沙蒿（Artemisia sphaerocephala）、小花碱茅（Puccinellia tenuif lora）、白刺（Nitr aria tangutor u m）的氨基酸同源性亦高，均在94%以上，这几种植物均是选自不同科的盐生植物，但他们Actin基因氨基酸的同源性却很高，这又进一步说明Actin是一种高度保守的蛋白。

2．4 Actin基因不同器官的表达特性分析

利用荧光定量RT－PCR 分析从盐生草中分离Actin基因的表达情况，盐生草Actin基因在盐生草植株的根、茎、叶中都有表达，且各器官的表达量结果恒定，无显著差异（P＞0．05）（图6），进一步说明了克隆的Actin基因具有表达稳定性的特点。

图5 盐生草与其他植物Actin基因氨基酸序列同源性分析Fig．5 Amino acid sequence homology analysis of Halogeton glomer atus with other plant Actin

图6 Actin基因在植株不同器官的表达量Fig．6 Expression of Actin gene in different organs

3 讨论

3．1 Actin基因是一种高度保守的管家基因

Actin基因编码的肌动蛋白是一种在植物中普遍存在而又非常重要的结构蛋白［11］。通常，Actin基因在核苷酸和氨基酸水平上都具有高度的同源性和保守性，因而在研究植物生命活动过程中其作为管家基因发挥着不可替代的作用［12－14］。本试验克隆到的盐生草Actin 基因片段为598 bp，与选定的这几种植物的Actin基因编码的氨基酸序列同源性则在94%之上，这无疑表明盐生草Actin 基因是一种高度保守的管家基因。

3．2 盐生草Actin基因表达稳定

随着植物肌动蛋白研究方法的不断改进提高，对其结构与功能有了越来越多的认识。高等植物的Actin基因编码的肌动蛋白主要有两类：营养型和生殖型，其表达具有组织特异性，并且在大部分的组织和器官至少有两种以上的肌动蛋白异型 体 同 时 表 达［15－17］。比 如，在 拟 南 芥（Ar abidopsis thaliana）中的肌动蛋白基因超过20 个，杨树（Popl ar）的肌动蛋白基因也不少于22 个［18］。选择一个满意的内参基因应该在不同组织和器官中具有稳定表达的特性。本研究用荧光定量RTPCR技术分析了盐生草Actin 基因不同器官的表达模式结果表明，盐生草Actin 基因表达稳定，无显著差异性。

3．3 盐生草Actin基因是适宜的内参基因

信号转导途径中最重要的一步反应是植物肌动蛋白的动力学变化。不同信号转导途径的蛋白通过直接作用于肌动蛋白来改变细胞的组织结构，细胞接收某些信号，并将其转导给目标，使所有细胞有应答反应［19－20］。在动物和植物细胞中，细胞骨架都是一个很主要的信号级联放大的靶目标，植物肌动蛋白是细胞骨架的重要组成部分［21］。盐生草作为一种典型的盐生植物，其自身蕴含着丰富的耐盐基因，具有与非盐生植物截然不同的信号转导途径和调控机制，研究盐生草基因耐盐调控机制及相关表达模式，内标参照是不可缺少的，而本试验研究得出的盐生草Actin基因具有高度保守并且表达量恒定的特性，可作为内标参照，为下一步研究盐生草耐盐碱相关功能基因表达提供了内参依据。

［1］ 陈颖，王刚，赵俊霞．高等植物体内的肌动蛋白［J］．生物学通报，2003（1）：13－15．

［2］ Staiger C J，Schli wa M．Actin localization and f unction in higher plants［J］．Protoplasm，1987，141（1）：1－12．

［3］ 朱筱娟，曾宪录，宋朝霞．细胞核内肌动蛋白及其功能研究进展［J］．科学通报，2004，49（11）：1029－1035．

［4］ 刘曦，张少斌，汪澈．植物肌动蛋白功能的研究进展［J］．生物技术通报，2010，35（3）：13－16．

［5］ Thellin O，Zorzi W，Lakaye B．Housekeeping genes as internal standards：Use and limits［J］．Journal of Biotechnology，1999，75（2）：291－296．

［6］ Tho mas C，Meyer D，Wolff M．Molecular characterization and spatial expression of the sunflower ABPI gene［J］．Plant Molecular Biology，2003，52（4）：1015－1035．

［7］ 贾恢先，孙学刚．中国西北内陆盐地植物图谱［M］．北京：中国林业出版社，2005：38－40．

［8］ Sun H Y，Zhang X M，Li L，Ma J B．Esti mation on above ground bio mass and t he characteristics of population families of t he halophilous her baceous plants in t hree different areas of south Tari m Basin［J］．Jour nal of Arid Land Resources and Environment，2008，20（4）：193－197．

［9］ 伍国强，席杰军，包爱科．多浆旱生植物霸王Actin基因片段的克隆及序列分析［J］．生物技术通报，2008，34（2）：101－104．

［10］ Wang J C．Physiological and proteo mic analyses of salt stress response in the halophyte Halogeton glomer atus［J］．Plant，Cell and Environ ment，2014，13（2）：37－40．

［11］ 陈颖，赵俊霞，郝丽梅．花粉肌动蛋白研究进展［J］．生物学杂志，2002，89（3）：5－8．

［12］ 卫青，杨金宏．桑树肌动Actin基因全长序列的克隆与分析［J］．广西植物，2012，32（3）：362－366．

［13］ 阮桢媛，陈晓鸣，杨子祥．角倍总RNA 提取方法建立及Actin基因片段克隆［J］．林业科学研究，2012，25（5）：551－557．

［14］ Tamura K，Dudley J，Nei M．MEGA4：Molecular evolution－ary genetics analysis（MEGA）soft ware version 4．0［J］．Molecular Biology and Evolution，2007，24（8）：1596－1599．

［15］ Wang S Y，Zhang Y C，Li L，Zhang J L，Wang C M，Guo Q，Bao A K．Cloning and sequ－ence analysis of Actin gene fragment fro m salt－exclusion halophyte Puccinellia tenuif lor a［J］．Geno mics and Applied Biology，2009，28（4）：673－677．

［16］ Pang Q，Chen S，Dai S，Chen Y，Wang Y，Yan X．Comparative proteomics of salt tolerance in Arabidopsis thaliana and Thell ungiell a halophil a［J］．Jour nal of Proteo me Research，2010，45（9）：2584－2599．

［17］ Tuteja N．Mechanis ms of high salinity tolerance in plants［J］．Methods in Enzy mology，2007，428（6）：419－438．

［18］ 郭景康，陈青云．拟南芥、水稻和杨树ACTIN 家族全基因组分析［J］．上海大学学报：自然科学版，2009，15（4）：426．

［19］ Vantard M，Blanchoin L．Actin poly merization processes in plant cells［J］．Current Opinion in Plant Biology，2002，57（5）：502－506．

［20］ 张少斌，任东涛，徐小静．豌豆肌动蛋白异型体PEAc1与绿色荧光蛋白融合基因的原核表达与特性分析［J］．科学通报，2004，49（6）：563－569．

［21］ Daz－camino C，Conde R．Actin expression is induced and three isof or ms are differently expressed during ger mination in zea mays［J］．Jour nal of Experi mental Botany，2005，56（6）：557－565．