蒺藜苜蓿EMS 诱变突变体库的构建及突变体表型的分析

陈天龙，王彦荣，王 宇，张吉宇，刘志鹏

(草地农业生态系统国家重点实验室 兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州730020)

随 着 拟 南 芥(Arabidopsis thaliana)［1］和 水 稻(Oryza sativa)［2］等模式植物基因组测序的完成，植物的功能基因组研究进展迅速。目前已经发展了多种分析鉴定基因功能的方法，如转基因技术、基因沉默技术、基因敲除技术等，其中最为直接有效的方法是构建饱和的基因突变体库，利用突变体和突变基因之间直接的因果关系分析鉴定基因功能［3-4］。拟南芥、水稻等模式植物的功能基因组研究已充分表明，该方法在阐明基因功能方面发挥着重要作用。

化学诱变是构建突变体库的重要方法之一［5］。目前，使用较多的化学诱变剂是甲基磺酸乙酯(EMS)。与其他的理化诱变剂相比，EMS 可直接对种子进行处理，无需组织培养的过程，诱变后用转基因方法获得感兴趣的突变体更省时、省力［6］;另外，EMS 具有诱变率高、范围广、诱变类型丰富且得到的突变体多为点突变等特点，因而被广泛用于构建突变体库［7-12］。目前，利用EMS 诱变已构建了拟南芥［13］、玉 米(Zea mays)［14］、大 麦(Hordeum vulgare)［15］、小麦(Triticum aestivum)［16］等模式植物的突变体库并在基因的功能分析上进行了深入研究。Slade 等［16］利用EMS 诱变分别构建了普通小麦和硬粒小麦的突变体库，同时以小麦颗粒淀粉合成酶Ⅰ基因片段为引物，筛选出了多个突变体。Chiu等［17］用EMS 处理拟南芥种子，获得了拟南芥突变体库，并深入分析了TORNADO2 基因在花器官发育中的作用。于秀普等［18］利用EMS 和平阳霉素共同处理大豆(Glycine max)种子，对变异株进行连续选择，选育出具多种优良性状的冀豆8 号，已经大面积推广种植。根据Maluszynski 等［19］的报道，得益于诱变技术的应用，全世界研究人员已经从154 种植物中培育出了1 737 个品种，并在生产实践中产生了巨大的价值。

蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)作为豆科模式植物，耐干旱、耐冷热、高产、优质，又能改良土壤，因而被广泛栽培利用［20］。与其他豆科植物相比，蒺藜苜蓿具有遗传转化率高、生长周期短、基因组较小、自花授粉等优点，因而在植物分子生物学和基因组学研究中备受关注［20］。蒺藜苜蓿和大部分豆科植物有遗传上的相似性，如紫花苜蓿(M. sativa)、大豆、豌豆(Pisum sativum)和三叶草(Trifolium sp.)等，从蒺藜苜蓿获得的信息可以用于其他豆科植物，因此创建蒺藜苜蓿突变体库，不仅可以促进豆科作物和豆科牧草的遗传学和基因组学的研究，而且在发掘豆科植物的遗传资源，促进豆科作物和豆科牧草育种方面具有重要的意义［21］。在过去十多年中，在蒺藜苜蓿基因组测序和研究上已经取得了很多的成果，然而有关蒺藜苜蓿EMS 突变库建立的报道甚少，虽然国外已经构建了一些EMS 突变体库［22-23］，但还远没有达到饱和状态。本研究以0.15% EMS诱导蒺藜苜蓿A17 种子，以期获取M2代突变植株，初步构建蒺藜苜蓿的突变体库，旨在为蒺藜苜蓿分子遗传学研究、基因功能分析和种质资源创新提供有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

试验用蒺藜苜蓿A17 种子由美国Samuel Roberts Noble 基金会提供。诱变剂EMS 购自中国绿园公司。

1.2 诱变处理

首先精选A17 成熟种子，用浓硫酸处理5 min打破硬实，并用蒸馏水冲洗5 次以上。接着将种子置于4 ℃冰箱磷酸缓冲液(100 mmol·L-1，pH 7.0)中预浸12 h。然后用磷酸缓冲液配制0.15%(V/V)的EMS 溶液，室温黑暗条件下处理种子15 h，期间翻转轻摇。最后用蒸馏水冲洗EMS 处理种子3 次，每次30 min，以去除种子上残留的EMS。

1.3 M 1 代试验

2012 年4 月将处理后的种子播种于花盆，温室适宜条件下生长出苗后记为M1代植株。植株生长期间，统计成活总株数以及突变株数，同时以野生型为对照观察M1代植株突变性状的形态学表现，分类统计鉴定，挂牌作标记并拍照，10 月收获M1代种子保存。

1.4 M 2 代试验

2012 年11 月从M1代收获的种子中选择200份单株种子，每个单株为一个株系，每个株系种植10 株，并将M1代其余种子存入种质资源库。M2代出苗后仔细观察蒺藜苜蓿生长各个时期的突变情况，并将野生型和诱变后的材料作为对照，记录突变表型。2013 年4 月按单株收获后存放(M2代种子)。

突变株频率=突变株数/成活总株数×100%。

2 结果与分析

2.1 M 1 代表型性状突变筛选

经EMS 诱变处理后的A17 种子播种出苗后，在全生育期内长势与对照比较差异明显。具体表现为种子发芽时间延迟，相比野生型出苗期推迟了3 d，发芽率和成苗率都明显下降，分别为58.0%和43.5%，突变植株即使成活，苗期也表现出早期生长缓慢、成株后生活力弱等特点。部分突变植株的叶片色泽、叶片形状发生变异，成株后可观察到部分株高、育性、成熟期突变等变异类型，并且有些突变体表现出嵌合体的特征。整个M1代共发现1 982 株在叶色、叶形、育性等性状上有明显表型突变的植株，突变率为16.52%。然而，田间调查显示M1多数表型变异无法遗传给M2代，即这些表型的变化在M2代可以得到恢复。

2.2 M 2 代突变表型的筛选

对M2代200 个株系的叶色、叶型、株型、开花期等主要农艺性状进行了调查统计，结果表明EMS诱变的蒺藜苜蓿A17 M2代群体的各性状均发现了突变株(表1)。

表1 M 2 代植株突变表型性状统计Table 1 Statistics of the characters of mutant phenotype observed in M 2 generation plant

图1 观察到的M 1 代植株代表性突变表型Fig.1 Representative mutant phenotypes observed in M 1 generation plant

2.2.1 叶色、叶型性状突变 统计结果表明，M2代群体中共观察到177 株叶片突变的植株，其中叶色变异包括6 种类型，分别表现为叶斑突变(图1d)、叶深绿、杂色叶(图1c)、叶红紫、叶片黄萎以及白化苗，突变率为5.38%;叶型变异包括皱叶(图1f)、窄叶、卷曲和多叶(图1b)，突变率为3.12%。其中白化株单株的产量少、结实率低，并且大部分在苗期死亡;幼苗期黄化株的成活率也相对较低，共获得45株，能够成活的白化株和黄化株随着植株的生长叶色逐渐转绿，生长后期突变表型逐渐消失;叶片褶皱突变体的叶片表面表现出凹凸不平或皱褶，共计6株;叶片深绿的植株共3 株，其叶片薄而叶色深，株型大且结荚率高;杂色叶植株基部叶片均在生长后期衰老较慢，株型也较野生型矮且小;叶片卷曲植株共计16 株，相比于对照野生型植株衰老较早;多叶性状植株9 株，突变率为0.43%。由此可见，叶片卷曲和杂色叶突变性状在叶片突变类型中频率较高，突变频率最高的为叶片黄萎和窄叶，深绿色叶片及叶片褶皱的突变率最低。利用这些叶性状突变体可以进行苜蓿叶片的光合作用机理以及光合形态建成的研究。

2.2.2 株型性状突变 A17 成熟期出现的植株突变类型包括高秆、矮化、匍匐、半匍匐、多分枝和少分枝(表1)。其中株高大于110 cm 的高秆突变株(对照平均73 cm)共18 株，其特点为分枝多、植株长势强;株高40 cm 以下的矮秆共37 株，其植株矮小且长势弱;分枝数13 个以上的多分枝类型(野生型为8 个)共62 株，其植株高且种子产量多;匍匐型和半匍匐型植株分别为22 株和14 株。综上所述，多分枝植株的突变频率为2.97%，是株型性状的突变中突变频率最高的，而半匍匐最低，仅为0.67%。这些丰富的突变材料对构建性状优良的蒺藜苜蓿理想株型有一定的帮助。

2.2.3 开花期性状突变 经EMS 诱变后，A17 开花期受到明显影响。M2代中共发现12 个早花植株(较野生型提前13 d 以上)和9 个晚花植株(较野生型推迟15 d 以上)，突变频率分别为0. 58% 和0.43%。

2.3 EMS 诱导蒺藜苜蓿突变的变异效应

观察发现，突变材料在不同的生育时期表现出不同的突变类型，突变类型可大致分为3 类:多数株系内的突变植株中出现2 株或2 株以上具有相同的突变类型;有些株系出现多重突变体，即同一株系出现2 种或3 种不同类型突变性状;部分株系只发现一种突变类型的植株。相比较而言，Ml代突变频率最高的为杂色叶类型，达到5.97%，迟花的突变频率最低，仅为1.02%，M2代突变频率最高的为多分枝，突变频率为2.97%，最低的为深绿色叶片，为0.14%。

EMS 诱变可以引起大量功能基因发生点突变，从而造成不同基因的等位变异，对这些等位变异与相应性状间的关系进行深入调查和分析，将有助于进一步清楚基因的功能。另外，根据人们的生产需要进行农艺性状比较，可筛选出优质稳定的等位变异体。EMS 这类化学诱变对农艺性状的诱变多数为不良突变，优良突变相对较少。因此，需处理大量的待诱变材料，以期获得较多的优良突变。本试验获得了少数重要农艺性状优于野生型的突变植株，如早花、多分枝和株高突变体等材料。一方面，这些优良的农艺性状是利用化学诱变手段得到的，因而可以进一步深入研究控制这些优良性状的新基因或新的等位变异;另一方面，由于蒺藜苜蓿是优良的豆科牧草，因此可通过连续回交等传统育种技术，将来自该突变体库的部分优良性状突变体作为育种亲本，在育种上得到应用。

经过筛选和整理共获得叶色性状、叶型性状、株型性状、开花期四大类性状的突变体共388 份，初步建立突变体库。某些叶片斑点、植株黄化和失绿表型的植株通常情况下不能正常繁殖，是由于其作为纯合体存活能力差，此类突变体的种子可以在杂合状态下进行单株种子的保存，解决了此类植株由于自身不能正常繁殖而导致种子不能保存的问题。对于一些突变频率极低、成熟期很晚的突变体或由于生理和环境原因不能正常繁殖的突变体，可在M2代中通过株系准确找到，为以后研究突变体之间的亲缘关系提供帮助。

3 讨论与结论

牧草育种的最终目的是能够培育出产量高、品质优的品种，但是在育种工作中由于集中利用相同的种质资源，导致品种对环境的适应性降低，成为限制苜蓿产量和品质提高的瓶颈。转变这种现状的有效和可行的途径之一就是利用诱变育种和分子育种相结合的方法，即通过理化诱变产生突变体，再经多代观察和鉴定，培育高产、优质的新种质资源。近年来，利用化学诱变构建突变体库的手段已成为创造新型种质资源的一个重要内容［24-25］，并且相对比较成熟。其中，通过EMS 诱变方法培育优良种质的研究更是获得了很大的成就。刘治先［26］利用EMS 诱变玉米获得了多个高油酸和高蛋白的突变体，为玉米育种提供了优质的材料。张凤启等［27］利用EMS诱变甘蓝型油菜(Brassica napus)，获得了大量的形态和品质性状的突变体。但是该技术还主要集中运用在对农作物突变体库构建上，而运用牧草及饲料作物构建突变体库的研究尚处于起步阶段。本研究以蒺藜苜蓿A17 为试验材料，采用EMS 化学诱变的方法，研究了EMS 对蒺藜苜蓿生长情况的影响以及突变植株农艺性状的形态学表现，初步构建了蒺藜苜蓿EMS 诱变的突变体库。

植物各组织和器官经诱变处理后均可能发生表型的突变，但各种表型的突变频率不同。Tadege等［23］用反转录转座子插入方法诱变蒺藜苜蓿，发现M2代群体中突变类型最多的为株型性状，其次为叶色性状。本试验用EMS 诱变处理蒺藜苜蓿A17 种子，发现在M2代中突变类型最丰富的是株型性状和叶色性状，而开花期突变频率最低，仅有21 株，此结果与Tadege 等［23］的研究结果相似。这种现象可能是由于不同性状的遗传体系造成的，如叶型、叶色、株型性状等受到多基因的控制［28-31］，多个基因中的少数基因突变都能造成性状表型的改变，进而提高突变的频率。而其他一些性状突变频率较低，是因为在少数关键的基因上发生点突变，最后产生表型变异。

有报道称，EMS 诱变最佳剂量与植物基因组大小呈正相关，即植物基因组越大诱变所需要的剂量越大［32］。然而在比较了拟南芥、小麦、玉米、大豆等不同植物成功构建突变体库中使用的最佳剂量后发现，这个假设是不完全正确的。实际上，EMS 诱变最佳剂量受多个因素影响，如诱变材料自身的性质、诱变材料的抗逆性等。其中种子的保护程度是一个非常重要的因素。水稻和小麦的种子都有较厚的外壳保护，即水分渗透所需的时间较长，所以诱变所需的剂量可能就相对较高，而拟南芥、油菜等种皮较薄，几乎无法阻止水分的渗透，所以诱变所需的剂量可能就相对较低。本试验所用的EMS 诱变蒺藜苜蓿的半致死剂量为0.15%，相比EMS 诱变大多数植物的半致死剂量要低。

EMS 诱变后产生的突变频率高。EMS 诱发诱变的甘蓝型油菜的突变密度为1/41.5 kb［33］、拟南芥为l/170 kb［34］、六倍体小麦为1/25 kb［35］。EMS诱变的效果虽然是随机诱变，但是只要对诱变后的突变植株根据需要定向选择，就可得到有生产价值的突变材料［36］，因而EMS 是最普遍而且高效的诱变剂。本试验通过EMS 诱变蒺藜苜蓿A17 也获得了一些早花、多分枝、株高高等突变体，在后续育种试验中，可以有目的地针对某个优良的性状，如多分枝和高秆突变体进行多代追踪，并结合传统的育种技术，从而选育出高产优质的育种材料。

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