热研5号柱花草高频、优质愈伤组织的诱导

钏秀娟，陈彩虹，罗丽娟

(1.海南大学园艺园林学院，海南 海口 570228； 2.海南大学农学院，海南 海口 570228)

热研5号柱花草高频、优质愈伤组织的诱导

钏秀娟1，陈彩虹1，罗丽娟2

(1.海南大学园艺园林学院，海南 海口 570228； 2.海南大学农学院，海南 海口 570228)

本研究按应用正交试验，以MS为基础培养基，分析热研5号柱花草(Stylosanthesguianensiscv. Reyan No.5)在诱导高频、优质愈伤组织过程中激素6-BA、2,4-D浓度和外植体类型对诱导效果的影响。结果表明，6-BA是影响柱花草愈伤组织的诱导率以及褐化率的最主要因素，其次是2,4-D和外植体；柱花草愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2,4-D(0.2～0.5 mg·L-1)+3%蔗糖+0.7%琼脂粉，pH 5.8。子叶、真叶、下胚轴、生长点、上胚轴、根均能诱导愈伤组织，根的愈伤诱导率为80%，其余外植体的诱导率均在95%以上，下胚轴上段形成的愈伤组织芽的分化率高于其他外植体。

热研5号柱花草；正交设计; 组织培养

柱花草(Stylosanthesspp.)是豆科(Leguminosae)多年生草本植物，为世界热带地区栽培及应用最广泛的牧草[1]。1962年，我国首次将其作为橡胶园的覆盖作物引种到海南岛[2]。目前，柱花草已被推广种植到广西、云南、贵州、福建及四川的攀枝花等干热河谷地区[3]。但是低温、病害、杂草等胁迫条件的存在仍是柱花草更好更广泛利用的最大障碍[4]。抗病育种、提高产量、改善牧草营养品质和利用率是利用生物技术进行牧草品质改良的重要目标[5-6]。近年来国内外在利用体细胞融合技术、基因工程技术获得优良牧草品种方面开展了多项工作[7-11]，其中利用基因工程技术把外源基因导入植物中以获得优良材料的方法具有广阔的前景。

Scowcroft和Adamson[12]首次利用有钩柱花草(S.hamata)的胚根和子叶为外植体，诱导分化出愈伤组织，经继代培养，形成了具有根、茎、叶的完整小植株，成为了柱花草再生体系研究的标志。国内学者对柱花草再生体系的研究也做了一定的工作，但研究结果存在较大的差异，比如在激素的配合使用方面，有学者以热研2号柱花草(S.guianensiscv. Reyan No.5 )为材料选取真叶为外植体诱导愈伤，得出激素的最适配比为MS+NAA 2.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1[13]，或者MS+NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 4.0 mg·L-1[14]。因此,对培养基参数和激素配比等进行优化来提高出愈率、丛生芽的分化率和生根率，以建立更高效更完整的柱花草再生体系方面仍值得进一步研究。在前人的研究中所使用的激素主要是6-BA和NAA，但2,4-D对于豆科植物胚性愈伤的诱导也有极其重要的作用[15]。在研究苜蓿(Medicagosativa)再生体系的建立时，2,4-D是应用最广泛的生长素[16-18]。在柱花草研究中也有学者肯定了2,4-D的重要性[19]。此外外植体的选择对愈伤组织诱导的成功与否是非常重要的，不同外植体诱导出愈伤的状态大不相同，其质量与后续的分化培养关系密切。

本研究以热研5号柱花草为材料，以6-BA和2,4-D单因素试验为基础，采用正交设计法，选择不同种类的外植体，观察其芽分化的情况，旨在选出最优质的外植体，明确不同外植体、不同植物生长调节剂及不同浓度的组合对柱花草愈伤组织诱导和生长的影响，从而建立柱花草的高频优质再生体系，并为遗传转化体系的建立提供基础。

1 材料和方法

1.1 材料

植物材料为热研5号柱花草。

1.2 培养基和培养条件

以MS为基础培养基，附加3%蔗糖、0.7%琼脂粉，pH 5.8，培养条件为(28±1)℃，光照强度2 000 lx，光照时间为12 h·d-1。

1.3 试验方法

1.3.1 无菌苗的获得 热研5号柱花草种子磨去种皮，80 ℃ 热水处理5 min，70%酒精浸泡5 min，无菌水冲洗3次，10%次氯酸钠处理10 min，无菌水冲洗5次，种子置于无菌滤纸上吸干水分，接种到MS培养基上培养以获得柱花草无菌苗。

1.3.2 愈伤组织的诱导 在超净工作台上将苗龄7～8 d的柱花草子叶、真叶切成2 mm×2 mm大小，下胚轴切成5 mm长度的小段，分别接种到附加不同水平浓度的6-BA和2,4-D的MS培养基上。试验采用三因素三水平试验，正交表选用L27(313)正交表(表1、2)，其中A、B、C分别对应6-BA、2,4-D和外植体类型，A因素的3个水平为0、1、2 mg·L-1，B因素的3个水平分别为0、0.2、0.5 mg·L-1，C因素分别对应下胚轴、子叶、真叶。每个处理5个重复，每重复10个外植体，10 d继代一次，继代两次后观察出愈率、褐化率以及愈伤组织的色泽以及质地。对试验结果进行统计学分析，分析采用JMP软件进行。确定A、B、C 3个因素对愈伤组织诱导的影响，选出最适的愈伤组织诱导激素配比。出愈率为长出愈伤的外植体数与接种块数的比率，褐化率为褐化的外植体数所占接种外植体数的比率。

1.3.3 最佳外植体的选择 分别以苗龄7～8 d的第一真叶、上胚轴、子叶、顶端生长点、下胚轴上段(近子叶一端)、下胚轴中段、下胚轴下段(近根一端)、根为外植体，接种到愈伤组织诱导培养基上，待愈伤组织长出后将其接种到分化培养基(MS+6-BA 2.0 mg·L-1+3%蔗糖+0.7%琼脂粉,pH 5.8)上使其分化，6～7周后观察记录愈伤组织的分化情况，10 d继代一次。每个处理3个重复，每个重复15外植体，褐化和污染不计。

2 结果与分析

2.1 影响愈伤组织诱导的因素

下胚轴、子叶、真叶在接种4～5 d时，切口处出现膨大现象，其中以下胚轴最为明显。9～10 d时可见部分愈伤长出，培养18 d时已有大量愈伤形成，下胚轴的两端膨大、呈不对称的哑铃状，呈现形态学下部生长大于形态学上部的极性现象。外植体形成的愈伤组织从形态和质地上可分为4种类型：1)淡黄色水渍状,质地疏松，水渍化，轻捏即可破碎；2)黄褐色疏松状；3)绿色致密状，表面有点状突起属于状态相对较好的愈伤；4)淡绿色疏松状(图1)。 柱花草愈伤组织继代后4～5 d，部分组合的少数外植体有不定芽生成；柱花草愈伤组织诱导率、褐化率与激素的使用密切相关(表3)。只有在添加激素的情况下柱花草外植体才能长出愈伤组织；使用两种激素的情况下所诱导出的愈伤大部分呈现绿色致密状态，且生长情况较好；当6-BA为2.0 mg·L-1,2,4-D为0.2～0.5 mg·L-1时以及6-BA为1.0 mg·L-1,2,4-D为0.2～0.5 mg·L-1时,愈伤诱导率显著高于其他处理组合(P<0.05)，且愈伤组织的生长状态好，6-BA浓度为2.0 mg·L-1时愈伤组织诱导率较高，在出愈率较高的处理组合中,6-BA为2.0 mg·L-1、2,4-D为0.2 mg·L-1、外植体为子叶的处理的褐化率最低，与除A2B1C2外的其余A2处理组合差异不显著(P>0.05)，但与A3处理组合差异显著。

A因素的极差最大(表4)，C、B因素次之，由此得出3个因素中6-BA对柱花草愈伤组织诱导的影响最大，其次是外植体,2,4-D的影响相对较小。柱花草愈伤组织诱导率试验结果的方差分析(表5)表明，6-BA、2,4-D及二者的互作对柱花草愈伤组织诱导率的影响均有极显著影响(P<0.01)。

柱花草愈伤组织褐化率试验结果的方差分析(表6)表明，A、A×B、A×C因素对愈伤组织褐化率的影响达到显著水平(P<0.05)。A因素的极差大于B、C因素，所以参试的3个因素中6-BA对愈伤组织褐化率的影响最大(表7)。

综合愈伤色泽状态、生长情况、愈伤诱导率、褐化率以及统计分析结果可知，愈伤组织诱导最优配比组合为MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2,4-D (0.2～0.5 mg·L-1)+3%蔗糖+0.7%琼脂粉,pH值5.8。

注：Ⅰ,淡黄色水渍状愈伤；Ⅱ,黄褐色疏松状愈伤；Ⅲ,绿色紧实状愈伤；Ⅳ,淡绿色疏松状愈伤。

Note：Ⅰ, pale yellow and watery； Ⅱ, tawny and loosened； Ⅲ , dark green and compact； Ⅳ, green and loosened.

注：“+”表示生长的强弱，越多表示长势越好；同列不同小写字母表示不同处理组合间差异显著(P<0.05)。

Note：“+” in the table means the growing status, more “+” indicates stronger vigorous growth; Different lower case letters within same column mean significant difference among different test treatment at 0.05 level.

注：**表示差异极显著(P<0.01)。

Note：** mean significant difference at 0.01 level.

注：*表示差异显著(P<0.05)。

Note：* mean significant difference at 0.05 level.

2.2 外植体的选择

不同外植体均能诱导出愈伤组织，但出愈率和芽分化率有所不同。子叶、真叶、下胚轴、上胚轴、生长点的出愈率均在95%以上，愈伤状态以下胚轴上段最好，呈绿色紧实状，且表面有许多类似芽点的点状突起，第一真叶、生长点、下胚轴中段次之，此类外植体诱导的愈伤疏密度适中，与下胚轴上段相比表面的点状突起相对较少。根部的愈伤诱导率相对较低,仅有80%，且愈伤组织多数呈现疏松状态，近根部的下胚轴所诱导的愈伤与根部相似。继代培养一次后接种到芽诱导培养基上12～13 d时开始出现分化。各类外植体分化情况表明(图2)，近子叶端的下胚轴出芽率最高，第一真叶次之，根的出芽率最低，顶端生长点、下胚轴中段和上胚轴的出芽率差别不大，选取下胚轴上段(近子叶一端)为最佳外植体。

注：A，真叶；B，子叶；C，生长点；D，根；E，下胚轴上段；F，下胚轴中段；G，下胚轴下段；H，上胚轴； 不同小写字母表示不同外植体之间差异显著(P<0.05)。

Note：A.euphylla, B.cotyledon, C.the growing point, D.root, E.the upper hypocotyl, F.the middle of hypocotyl, G.the last hypocotyl, H.epicotyl; Different lower case letters show significant difference among different explants at 0.05 level.

3 讨论与结论

在植物组织培养中，植物生长调节剂用量虽然微小，但不可缺少。使用不同种类、不同浓度和不同比例关系的植物生长调节剂，可以调节培养物的生长发育进程、分化方向和器官发生[19]。正交试验不仅能分析各个因子的影响情况，还能体现出因素之间是否存在交互作用。本研究采用正交试验研究了6-BA、2,4-D和外植体对柱花草愈伤组织诱导的影响得出，6-BA是影响柱花草愈伤组织诱导率以及褐化率的最主要因素，其次是2,4-D和外植体，柱花草愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+6-BA2.0 mg·L-1+2,4-D(0.2～0.5 mg·L-1)+3%蔗糖+0.7%琼脂粉,pH 5.8,本研究还发现柱花草愈伤组织的诱导率还与6-BA与2,4-D互作有关。有研究得出，在生长素和细胞分裂素配合使用的情况下，愈伤组织诱导率显著高于单独附加其中一种激素[13]，在本试验中也得到证明。国外学者研究了NAA和6-BA对柱花草的愈伤组织形成使用比例[20]，但没有对诱导率和试验结果统计分析，对于柱花草愈伤组织诱导的关键因素尚不明确。本试验明确了影响热研5号柱花草愈伤组织诱导的关键因素。

有研究表明不同类型外植体在同一培养基上，其分化情况有较大差异[18]。本试验使用不同的外植体观察愈伤分化情况，结果表明，近子叶端的下胚轴诱导出的愈伤分化率最高，第一真叶次之，根的出芽率最低，顶端生长点、下胚轴中段和上胚轴的分化率差别不大。出现此情况可能是因为下胚轴属于胚性器官，细胞生长分裂能力较为旺盛。有学者以热研2号柱花草的真叶、刚展开的子叶为外植体进行试验，得出真叶的出愈率最高为89.5%，分化系数最高为10.27，选其为最佳外植体[21]。此外,在柱花草组织培养的过程中发现，愈伤组织的分化还与愈伤组织的状态存在很大关系，绿色致密型且表面点状突起较多的愈伤团芽分化能力强于表面点状突起较少的愈伤[22]。本研究结果可为柱花草愈伤组织诱导中培养基的配比和外植体的选择提供帮助。

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(责任编辑 王芳)

2014年12月国际市场主要饲料与畜产品价格分析

12月国际饲料价格跌涨互现，国际畜产品价格继续呈现下降趋势。

一、玉米、大豆、高梁、苜蓿粉、棉籽饼、豆粉市场价格上涨，菜籽、豆粕市场价格下降

12月份玉米、大豆、高梁、苜蓿粉、棉籽饼、豆粉市场平均价格分别为156.99、379.68、152.29、284.38、368.00、412.20美元·t-1,环比分别上涨6.8%、0.1%、8.6%、3.4%、5.2%、1.1%。菜籽、豆粕市场平均价格为402.10、378.24美元·t-1,环比分别下降0.7%、1.5%。

二、猪肉、牛奶、瘦肉猪、育肥牛、羊羔肉、羊肉、牛肉市场价格继续下降，鸡肉市场价格连续3个月平稳

12月份猪肉、牛奶、瘦肉猪、育肥牛、羊羔肉、羊肉、牛肉市场平均价格分别为1.81、0.33、1.81、4.84、3.57、2.19、5.67美元·kg-1,环比分别下降2.3%、8.8%、8.9%、7.3%、8.9%、6.9%、8.0%。鸡肉市场价格为2.51美元·kg-1，连续3个月平稳。

数据来源：国际市场商品价格网 http://price.mofcom.gov.cn/；中国农业信息网 http://www.agri.gov.cn/；鸡肉 http://www.indexmundi.com/；羊羔肉、羊肉 http://www.interest.co.nz/rural；牛肉http://www.thebeefsite.com/；猪肉 http://www.thepigsite.com/；货币汇率：http://qq.ip138.com/hl.asp。

(兰州大学草地农业科技学院 王迎新 整理)

Callus induction ofStylosanthesguianensiscv. Reyan No.5

CHUAN Xiu-juan1, CHEN Cai-hong1, LUO Li-juan2

(1.College of Horticulture and Landscapes, Hainan University, Haikou 570228, China; 2.College of Agriculture, Hainan University, Haikou 570228, China)

Effects of hormones 6-BA and 2,4-D and different explants on callus induction ofStylosanthesguianensiscv. Reyan No.5 were studied by orthogonal design statistic analysis. The results indicated that the main factor which influenced callus induction was 6-BA and the optimal medium for callus induction was MS medium with 2.0 mg·L-16-BA and 0.2～0.5 mg·L-12,4-D. All the explants using in the study included cotyledon, euphylla, hypocotyl, the growing point tissue, epicotyl, root, respectively could induce callus. The callus inducing rate of the explants were 95% except with that root was 80%. The budding rate of the callus from the upper hypocotyl was significantly higher than the callus from the other explants.

Stylosanthesguianensiscv. Reyan No.5; orthogonal design; tissue culture

LUO Li-juan E-mail：Luolj@123.com

2014-03-12 接受日期：2014-05-20

国家牧草产业技术体系热带牧草育种(CARS-35-03)

钏秀娟(1989-)，女，云南保山人，在读硕士生，研究方向为植物遗传转化。E-mail：504470504@qq.com

罗丽娟(1964-)，女，云南元谋人，教授，博士，研究方向为热带作物(木薯、热带牧草)的发育生物学、种质资源与遗传育种。E-mail：Luolj@123.com

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0107

Q943.1

A

1001-0629(2015)01-0078-07

钏秀娟,陈彩虹,罗丽娟.热研5号柱花草高频、优质愈伤组织的诱导[J].草业科学，2015,32(1)：78-84.

CHUAN Xiu-juan,CHEN Cai-hong,LUO Li-juan.Callus induction ofStylosanthesguianensiscv. Reyan No.5[J].Pratacultural Science，2015,32(1)：78-84.