菊芋叶蛋白提取工艺研究及氨基酸分析

俞梦妮，包婉君，谌馥佳，隆小华，刘 玲，刘兆普

(南京农业大学资源与环境科学学院，江苏省海洋生物学重点实验室， 江苏 南京 210095)

后生物生产层

菊芋叶蛋白提取工艺研究及氨基酸分析

俞梦妮，包婉君，谌馥佳，隆小华，刘 玲，刘兆普

(南京农业大学资源与环境科学学院，江苏省海洋生物学重点实验室， 江苏 南京 210095)

以新鲜菊芋(Helianthustuberosus)叶片为材料，研究叶蛋白的提取工艺。比较了4种提取剂对菊芋叶蛋白的提取效果，通过对叶蛋白得率、粗蛋白含量和粗蛋白提取率的比较，以焦亚硫酸钠溶液的提取效果最佳；在单因素试验的基础上，采用料液比、加盐量、絮凝温度、pH值多因素正交处理，对菊芋叶蛋白的提取工艺进行优化。结果表明，其最佳提取工艺条件为：料液比1∶7，加盐量0.5%，絮凝温度90 ℃，pH 2.0；对提取叶蛋白进行氨基酸分析的结果表明，菊芋叶蛋白氨基酸种类齐全，配比协调，总氨基酸含量为42.07%，必需氨基酸占总氨基酸的比值(E/T)为40.55%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值(E/N)为0.68。

菊芋；叶蛋白；提取；氨基酸

菊芋(Helianthustuberosus)，又称洋姜，为菊科向日葵属一年生草本植物，原产于北美洲，因其耐瘠、耐旱、耐病、适应性强，在各地均有栽培[1-2]。近年来，菊芋在食品[3]、生态保护[4]、生物能源[5-6]等方面应用广泛，是具有重要开发价值的新型经济作物。其块茎是生产菊粉和果糖的理想原料；茎叶的饲用价值高于马铃薯(Solanumtuberosum)和向日葵(Helianthusannuus)的基叶，可作为优良饲料[7]。

随着生活水平的提高，人类对蛋白质的需求不断增加，国内外都在致力于开发新的蛋白质资源，其中对植物叶蛋白的开发已引起人们广泛的关注[8]。叶蛋白(Leaf Protein Concentrate，LPC)亦称植物浓缩蛋白，是以新鲜牧草或其他青绿植物为原料，经榨汁后从汁液中提取的高蛋白质浓缩物[9]，必需氨基酸和非必需氨基酸含量丰富、种类齐全、配比合理。

菊芋叶片中含有蛋白质、氨基酸、还原糖类、生物酸以及油脂等化学成分[1]。目前，对菊芋叶蛋白的研究国内外相关文献报道较少。为此，对菊芋叶蛋白的提取剂选择、提取条件以及所提叶蛋白的氨基酸组成进行了初步的研究，旨在为菊芋的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以“南芋1号”菊芋叶片为材料，于2013年8月采自南京农业大学山东泰安试验基地，采回洗净后4 ℃冷藏备用。

1.2 主要仪器与试剂

8400全自动凯氏定氮仪(瑞典FOSS公司)；PB-10 sartorius pH计(赛多利斯科学仪器有限公司)；Allegre 63R高速冷冻离心机(美国BECKMAN公司)；电热恒温干燥箱(上海新苗医疗器材制造公司)；DK-8D型电热恒温水槽(上海一恒科学仪器有限公司)；JM-A2002电子天平(余姚纪铭称重校验设备有限公司)；日立L-8900型氨基酸分全自动析仪(日本日立公司)；JY-C020E多功能榨汁机(山东九阳家电有限公司)。

焦亚硫酸钠、氢氧化钠、氯化钠、盐酸均为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 菊芋叶蛋白的提取 将新鲜菊芋叶片剪切至1～2 cm小段，称取10 g按一定的料液比加入提取剂中。榨汁机榨汁2 min，200 mm滤布过滤得墨绿色提取液。用1 mol·L-1盐酸调pH，设定温度下恒温水浴中絮凝20 min。冷水冷却至室温，10 000 r·min-1离心5 min，得到叶蛋白沉淀物，60 ℃烘箱中烘干，得叶蛋白成品，称重并测定叶蛋白中粗蛋白的含量及叶蛋白得率[10-11]，计算粗蛋白提取率。

1.3.2 提取剂的选择 固定其他提取条件不变，比较水、氯化钠溶液、氢氧化钠溶液和焦亚硫酸钠溶液4种提取剂对菊芋叶蛋白提取率的影响，选择提取效果最好的一种溶剂提取叶蛋白。

1.3.3 提取条件单因素试验

1)料液比对提取的影响：在加盐量为0.3%、絮凝温度70 ℃、pH 3.0下，比较料液比为1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9和1∶11时的叶蛋白得率及叶蛋白中粗蛋白的含量，计算粗蛋白提取率，比较粗蛋白的提取效果。

2)加盐量对提取的影响：在料液比为1∶5、絮凝温度70 ℃、pH 3.0下，比较加盐量为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.8%时的粗蛋白提取效果。

3)絮凝温度对提取的影响：在料液比为1∶5、加盐量0.3%、pH 3.0下，比较絮凝温度为50、60、70、80和90 ℃的条件下粗蛋白提取效果。

4)pH对提取的影响：料液比为1∶5、加盐量0.3%、絮凝温度70 ℃下，分别调节pH至2.0、3.0、4.0、5.0和6.0比较粗蛋白提取效果。

1.3.4 提取工艺正交试验 为了明确各因素条件对菊芋叶蛋白絮凝效果的相互影响，寻求较优提取方法。以单因素试验为基础，以榨汁时间为2 min,絮凝时间为20 min的条件下选取料液比(A)、加盐量(B)、絮凝温度(C)、pH(D)，进行四因素三水平L9(34)正交试验(表1)。

1.3.5 菊芋叶片的氨基酸组成分析 按照GB/T1826-2000方法，样品在110 ℃、6 mol·L-1盐酸作用下水解24 h，用氨基酸自动分析仪测定除色氨酸外的17种氨基酸。

1.4 测定指标和方法

1.4.1 总蛋白含量的测定 按照GB/T5009.5-2010，采用凯氏定氮法测定菊芋叶片中粗蛋白的含量。

1.4.2 水分含量的测定 按照GB/T5528-2008，在(103±2) ℃恒温干燥，样品干燥前后质量差即为样品的水分含量。

1.5 数据处理

采用SPSS 20 和 Microsoft Excel软件对试验数据进行统计分析，用平均值和标准误表示结果。采用Origin 8.0软件制图。

2 结果与分析

2.1 菊芋叶片总蛋白含量和鲜叶水分含量

试验测得菊芋叶片的总蛋白含量为22.78%；鲜叶的水分含量为67.94%。

2.2 提取剂的选择

在料液比1∶5、加盐量0.3%、pH 3.0、絮凝温度70 ℃的条件下，不同提取剂对菊芋叶蛋白的提取效果差异显著(P<0.05)，以NaOH溶液为提取剂的叶蛋白得率显著高于其他3种提取剂(图1A)；对所提叶蛋白进行粗蛋白含量测定，结果表明,以Na2S2O5溶液提取的叶蛋白粗蛋白含量最高(图1B)；粗蛋白提取率的结果表明，4种提取剂对粗蛋白的提取效果最佳的为Na2S2O5溶液，粗蛋白提取率可达26.43%(图1C)。综上，用NaOH溶液提取菊芋叶蛋白虽然得到沉淀量多，但沉淀中大部分不是蛋白质，NaOH不适宜作为菊芋叶蛋白提取剂。Na2S2O5溶液对粗蛋白的提取效果高于其他3种提取剂，故选取Na2S2O5为菊芋叶蛋白的提取剂，进行后续试验。

2.3 菊芋叶蛋白提取条件单因素试验

2.3.1 料液比对提取的影响 在菊芋叶蛋白的提取过程中料液比对粗蛋白提取率影响较大(图2)，料液比为1∶7时粗蛋白提取率最高，为20.81%。在料液比为1∶(2～7)的区间内，粗蛋白提取率随料液比的增加而增大，但当料液比继续升高时，粗蛋白提取率逐渐下降。

注：不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。下同。

Note：Different low case letters indicate significant difference among different treatments at 0.05 level. The same below.

2.3.2 加盐量对提取的影响 加盐量从0.1%至0.4%，随着浓度的增加，粗蛋白提取率显著升高(P<0.05),至0.4%时达到最高，为22.35%；加盐量升至0.5%，粗蛋白提取率开始下降；浓度继续增加至0.8%，粗蛋白得率仍呈下降趋势，但降幅趋于平缓(图3)。

2.3.3 絮凝温度对提取的影响 在50―80 ℃的范围内，随着温度的逐渐升高，蛋白质的絮凝增强，产生的沉淀量增加，粗蛋白提取率呈显著上升趋势(P<0.05)。温度从70 ℃上升至80 ℃，粗蛋白提取率增加了11.16%；而从80 ℃上升至90 ℃时，粗蛋白提取率只增加了2.67%(图4)。说明80 ℃之后，随着温度的升高，粗蛋白提取率的增幅减缓。

2.3.4 pH对提取的影响 叶蛋白的最佳沉淀pH范围为3～4[12-13],因此选取酸性pH范围研究其对粗蛋白提取效果的影响。pH值由2.0升至3.0时，粗蛋白提取率升高，至3.0时粗蛋白提取率达到最大，为22.34%，pH值继续增大，粗蛋白提取率呈显著下降的趋势(P<0.05，图5)。

2.4 菊芋叶蛋白提取最佳工艺的研究

2.4.1 提取工艺正交试验 极差分析可知，各因素对叶蛋白得率的影响大小顺序为A>B>C>D，即料液比>加盐量>温度>pH，最佳提取条件为 A2B3C3D2组合；对粗蛋白含量影响的大小顺序为A>D>B>C，最佳提取条件为A1B1C3D1组合；对粗蛋白提取率的影响顺序与对粗蛋白含量的影响相同，最佳提取条件为A2B3C3D1组合(表2、3)。从各因素对3个指标的影响显著顺序看，因素A即料液比的影响最大，因素C的影响最小。综合考虑叶蛋白得率、粗蛋白含量和粗蛋白提取率，经各因素水平间的分析比较，确定叶蛋白最佳提取条件组合为A2B3C3D1，即料液比1∶7、加盐量0.5%、温度90 ℃、pH 2.0。

2.4.2 工艺验证试验 按上述确定的优化提取条件，进行菊芋叶蛋白提取最佳条件验证，平行3次，得到优化条件的平均叶蛋白得率为4.09%,平均粗蛋白含量为48.96%，平均粗蛋白提取率为27.36%，粗蛋白的提取效果高于正交试验结果。

2.5 菊芋叶蛋白氨基酸组成分析

对最佳提取工艺条件提取所得的叶蛋白进行氨基酸分析(表4)，结果表明，菊芋叶蛋白的氨基酸组成较齐全，含有包括7种人体必需氨基酸[14]在内的17种常见氨基酸。其中谷氨酸含量占氨基酸总量最高，为11.84%，其次是天门冬氨酸和亮氨酸，分别占氨基酸总量的10.43%和8.84%。必需氨基酸占总氨基酸的比值(E/T)为40.55%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值(E/N)为0.68，达到了世界粮农组织和卫生组织(FAO/WHO) 提出的E/T为40%和E/N为0.6的参考蛋白模式[15]。

3 讨论与结论

本研究所用材料是由南京农业大学选育的“南菊芋1号”，其叶片中蛋白质含量较高，经测定，全生育期叶片的粗蛋白含量平均为22.78%[1]，可作为蛋白质资源开发的优质原料。

叶蛋白的提取技术是目前叶蛋白研究的重点，研究表明，将叶片与提取剂按比例打浆，再以酸化加热法絮凝沉淀，可保证高蛋白质提取率[11]。选择适宜的提取剂，能最大限度地提取出叶片中的蛋白质，提高叶蛋白产量。大部分研究以水为提取剂，李道娥等[17]以NaCl溶液提取苜蓿(Medicagosativa)叶蛋白，江洪波和雷挺[18]以NaOH溶液为浸提剂提取桑叶(Morusalba)叶蛋白，朱宇旌等[10]采用Na2S2O5溶液提取苜蓿叶蛋白。考虑原料的差异性，本研究比较了以上4种提取剂对菊芋叶蛋白的提取效果，得出Na2S2O5溶液对粗蛋白的提取效果最佳，宜作为菊芋叶蛋白提取的溶剂。

注：*为必需氨基酸；蛋白质水解后色氨酸由于脱去NH4+后几乎完全被破坏[16]，并不说明样品中不含色氨酸。

Note：* is essential amino-acid; the tryptophan is destoryed by losing NH4+after proteolysis[16], which do not mean the sample lack of tryptophan.

菊芋叶蛋白的提取效果受料液比、加盐量、絮凝温度和pH等多种因素影响，单因素试验的结果表明，料液比为1∶7时提取效果最佳，料液比过低会导致浸提不充分，影响蛋白质的提取效果，反之则会造成提取液浓度过稀，蛋白质凝集下降；菊芋叶蛋白提取适宜的加盐量为0.4%，这可能是因为S2O52-与带正电荷的蛋白质基团结合，使蛋白质之间的静电排斥力增加，提高了蛋白质的溶解性，在一定的盐浓度范围内，溶解性随浓度的增加而增大，超过这个范围溶解度又开始下降[17]；加热会使大多数蛋白质形成不溶解的凝固体，且随着温度的升高，蛋白酶变性，酶反应速率减小，蛋白质絮凝增加，但温度过高会增加生产成本，建议实际生产中菊芋叶蛋白适宜的絮凝温度为80 ℃；pH对叶蛋白提取影响的原因在于蛋白质是表面带有正负电荷的两性电解质，pH会影响其在溶液中的解离状态和程度，当pH到达某一数值时，蛋白质颗粒表面聚集了数量相等的正负电荷，此时蛋白质呈电中性，其胶体溶液的稳定性最差，蛋白的沉淀量最大[19]，pH为3.0时菊芋叶蛋白沉淀最大。正交试验结果表明，料液比是影响叶蛋白提取效果的最主要因素，这与朱宇旌等[10]、周建建等[11]的研究结果相似。选择适宜的料液比能以最少的提取剂获得最多的蛋白质，这在叶蛋白提取中至关重要。

菊芋叶蛋白中氨基酸含量丰富，种类齐全，其中谷氨酸、天门冬氨酸和亮氨酸含量较高。这一结果与苜蓿[20-21]、紫云英(Astragalussinicus)[20]、繁缕(Stellariamedia)[22]叶蛋白的测定结果一致，这可能与植物叶片蛋白质的氨基酸组成特点有关。含量较高的3种氨基酸对新陈代谢起着重要作用，谷氨酸被人体吸收后，形成的谷酰胺能够清除新陈代谢过程中产生的氨；同时谷氨酸也是神经递质之一，可作为中枢神经系统的补剂[23]。天门冬氨酸能补充心肌因缺氧缺血而引起的底物耗损，参与心肌无氧代谢，促进糖酵解，可用于心肌保护[24]。亮氨酸能促进骨骼肌蛋白的合成，在骨骼肌和心肌蛋白质周转中扮演着重要角色[25]。近年来，菊芋叶片化学成分的研究取得了一定的进展[26]，但其氨基酸组成特点国内外尚未见报道，有待进一步研究。

综上，以Na2S2O5溶液为提取剂提取菊芋叶蛋白，在料液比1∶7、加盐量0.5%、温度90 ℃和pH 2.0的最佳提取条件下，叶蛋白得率为4.09%，粗蛋白含量为48.96%，粗蛋白提取率为27.36%。对所得叶蛋白的氨基酸组成分析表明，菊芋叶蛋白富含17种氨基酸，总氨基酸含量为42.07%，E/T为40.55%，E/N为0.68，达到FAO/WHO提出的参考蛋白模式，是一种具有开发价值的优质植物蛋白资源。

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(责任编辑 王芳)

Leaf protein extraction process optimization and analysis of amino acids contents ofHelianthustuberosus

YU Meng-ni, BAO Wan-jun, CHEN Fu-jia, LONG Xiao-hua, LIU Ling, LIU Zhao-pu

(College of Resources and Environmental Science, Key Laboratory of Marine Biology of Jiangsu Province,Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The extraction process of fresh leaf protein concentrate (LPC) ofHelianthustuberosuswas studied. Four kinds of extraction agents were evaluated based on the extraction rate of LPC, protein content of LPC and extraction rate of crude protein and the result suggested that sodium metabisulfite was optimal for protein extraction. In order to optimize the extraction process of LPC, the solid-liquid proportion, dosage of salt, temperature and pH were optimized by single factor and orthogonal test. The optimal LPC extraction process conditions were solid-liquid proportion of 1∶7, salt dosage of 0.5%, temperature at 90 ℃ and pH 2.0. The amino acid content analysis suggested the LPC was rich in all kinds of amino acid with harmonious proportion. The total content of amino acid was 42.07%, the ratio of essential amino acids and total amino acids (E/T) was 40.55% and the ratio of essential amino acids and non-essential amino (E/N) was 0.68.

Helianthustuberosus; leaf protein concentrate; extraction; amino acid

LIU Ling E-mail：liuling@njau.edu.cn

2014-03-19 接受日期：2014-09-04

江苏省农业科技自主创新资金项目[CX(12)1005-06]；国家科技支撑项目(2011BAD13B09)

俞梦妮(1990-)，女，浙江嵊州人，在读硕士生，研究方向为植物资源利用。E-mail：2012803170@njau.edu.cn

刘玲(1973-)，女，安徽石台人，副教授，博士，研究方向为植物资源开发及利用。E-mail：liuling@njau.edu.cn

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0120

Q946.1

A

1001-0629(2015)01-0125-07

俞梦妮，包婉君，谌馥佳，隆小华，刘玲，刘兆普.菊芋叶蛋白提取工艺研究及氨基酸分析[J].草业科学,2015,32(1):125-131.

YU Meng-ni,BAO Wan-jun,CHEN Fu-jia,LONG Xiao-hua,LIU Ling,LIU Zhao-pu.Leaf protein extraction process optimization and analysis of amino acids contents ofHelianthustuberosus[J].Pratacultural Science，2015,32(1)：125-131.