草地早熟禾根际固氮菌的培养

许沛冬，赵 艳，张晓波，李新英

(1.海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室，海南 海口 570228；2.海南大学农学院，海南 海口 570228； 3.内蒙古乌兰察布市农牧业局，内蒙古 集宁 012000)

草地早熟禾根际固氮菌的培养

许沛冬1,2，赵 艳2，张晓波1,2，李新英3

(1.海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室，海南 海口 570228；2.海南大学农学院，海南 海口 570228； 3.内蒙古乌兰察布市农牧业局，内蒙古 集宁 012000)

从草地早熟禾(Poapratensis)根际土壤中筛选得到8 株具有较高固氮、溶磷能力的高效固氮菌菌株，研究其培养条件及典型生长曲线。结果表明，本研究筛选得到的菌株对温度的适应范围比较广，在20～40 ℃的环境条件下可以正常完成新陈代谢及繁殖发育，最适生长温度为25 ℃；菌株在中性或偏碱性的条件下生长较好，最适生长初始pH值为7.0～7.5；菌株N4、N5、N10、N16、N17、N20的最佳通气量为220 mL，菌株N2、N14的最佳通气量分别为200及100 mL。根据所得数据，进一步试验，得到了固氮菌菌株的典型生长曲线，绝大部分的菌株在培养2 h后就进入了对数生长期，不同的菌株进入延时期、对数期、稳定期、衰亡期的时间及持续时间也不同。

草地早熟禾；固氮菌；培养条件；典型生长曲线

草地早熟禾(Poapratensis)是我国草坪建植的主要冷季型草坪草之一，被广泛应用在我国北方地区，它喜爱温暖潮湿的环境，且抗寒性强，温度域较宽[1]。植物根际微生物的数量变化以及群落结构的变化与植物的生长发育有着密切的联系，一方面可以影响到植物对水分及养分的吸收，另一方面也影响着植物对不良环境的抵抗能力[2-3]。而其中禾本科植物根际固氮菌更是对其宿主植物的生长具有直接提供氮素、产生植物激素等促进作用[4-5]，得到了人们的广泛关注与研究。为了获得高效的菌株以促进生物菌肥的研制，植物根际固氮菌生长环境以及培养条件的研究[6-7]也随之展开，其中重点集中在温度、光照、pH值、需氧量等方面。

一般而言，影响微生物生长的环境条件主要包括物理及化学两个方面的因素[8]，其中，温度、pH和氧气是影响微生物体内多种生物化学反应及细胞生命活动最重要的因素。对根际促生菌(PGPR)而言，适宜的温度有利于提高其生物活性，同时在最适宜的温度条件下，菌株细胞可以最大限度地产生所需要的代谢产物[8]；而pH与微生物的生命活动有着密切联系，不仅能直接影响细菌细胞的生命活动，还可以通过微生物主导的硝化作用降低重金属对根系的毒害，同时对于固氮菌来说，通过pH的调节可以使其表达出较高的固氮酶活性[9-11]；环境中氧气是否存在或者存在量的多少都会直接影响到微生物的生长过程，在某些情况下，有些微生物的代谢方式会因生长环境中氧气浓度的变化而变化，进而直接影响到微生物的生长速率[8]。

本研究分析温度、pH、通气量对草地早熟禾根际土壤中经过分离纯化、效能测定筛选出的8株固氮菌株的影响，并根据上述研究结果测定固氮菌株的典型生长曲线，进而为禾本科植物根际促生菌最适生长条件的研究以及菌株扩大繁殖、生物菌肥的研制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 菌株从山西晋中地区生长3年的健康纯草地早熟禾的根际土壤中分离纯化而来，经生物效能测定得到具有较高固氮、溶磷、分泌生长素的固氮菌共8株，分别编号为N2、N4、N5、N10、N14、N16、N17、N20。

1.1.2 培养基及主要仪器

Luria-Bertani培养基(LB)[12-13]：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 8.0 g，Agar 20 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0。

主要仪器：HZO-F160型全温振荡培养箱，LDZX-75KB高压蒸汽灭菌锅，721型分光光度计，便携式CP-401型pH计。

1.2 试验方法

采用比浊法测定不同条件对各供试菌株生长的影响，并设立空白对照[14-16]。

1.2.1 温度条件对菌株生长的影响测定 将固氮菌菌株按2%的接种量，接种至装有LB液体培养基的试管中，每个菌种接种4支试管，分别标记为10、15、20、25、30、35、40、45 ℃；按照标记温度，在振荡培养箱中在转速180 r·min-1下，培养48 h后测定每管菌株的OD600吸光值。

1.2.2 初始pH值对菌株生长的影响测定 用1 mol·L-1的NaOH和1 mol·L-1的HCl调节装有LB液体培养基试管内的pH值，标记pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，将固氮菌菌株按2%的接种量，接种至上述液体试管培养基，每个菌种接种4支试管，按照标记pH，在振荡培养箱中28 ℃转速180 r·min-1下，培养48 h后测定每管菌株的OD600吸光值。

1.2.3 通气条件对菌株生长的影响测定 将固氮菌株按5%的接种量，接种至LB液体培养基5个不同装液量的250 mL三角瓶中，分别为30 mL装液量(设定通气量为220 mL)、50 mL装液量(设定通气量为200 mL)、100 mL装液量(设定通气量为150 mL)、150 mL装液量(设定通气量为100 mL)、180 mL装液量(设定通气量为70 mL)，在振荡培养箱中28 ℃转速180 r·min-1下，培养48 h后测定每管菌株的OD600吸光值。

1.3 数据分析

所有数据用Excel整理，采用DPS(7.05)统计软件分析，用Tukey法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 温度条件对菌株生长的影响

从草地早熟禾根际所筛选的固氮菌株在10～45℃的温度范围内都能够正常生长(图1)，可见本研究所筛选得到的菌株对温度的适应范围较广，属宽温微生物。大部分菌株在20～30 ℃时OD600吸光值最高，其中菌株N2、N14、N20在30 ℃时OD600吸光值最高；菌株N4、N17在20 ℃时OD600吸光值最高；菌株N5、N10及N16在25 ℃时OD600吸光值最高，即分别为对应这些菌株的最适生长温度。根据方差分析，所测8株菌株最适温度差异不显著(P>0.05)，即20～30 ℃菌株生长状况均良好。

图1 温度条件对固氮菌株生长的影响

2.2 初始pH值对菌株生长的影响

固氮菌株可以在pH 4.0～9.0生长，但根据菌液的OD600吸光值，8株固氮菌株最适生长pH值为7.0～7.5(图2)，且差异不显著。具体来说，菌株N2、N4、N14、N16最适pH值为7.0，菌株N5、N10、N17、N20最适pH值为7.5。据方差分析，8株固氮菌菌株最适初始pH值差异不显著，即所测8株固氮菌株在中性或偏碱性的条件下生长良好。

图2 pH条件对固氮菌株生长的影响

2.3 通气条件对菌株生长的影响

菌株N4、N5、N10、N16、N17、N20通气量为220 mL时生长最好，越高的氧分压对于这6株菌株的生长越有利；菌株N2在通气量200 mL时最适宜其生长，在通气量为220 mL时生长受到一定的阻碍；而菌株N14则在通气量为100 mL时生长最好(图3)。据方差分析，N4、N17与N20在通气条件下生长差异显著(P<0.05)，而与其他菌株相比差异不显著(P>0.05)。

2.4 典型生长曲线

菌株N2、N4在2～16 h曲线明显上升到达对数生长期，菌体经过16～20 h的大量繁殖后逐渐进入稳定期，多数菌株生长曲线在20 h后明显下降，说明菌株开始进入衰亡期(图4)；菌株N5、N10延迟期为0～4 h后，4～14 h进入对数生长期，14～18 h为稳定期，18 h之后进入衰亡期；菌株N14、N16于2～12 h时进入对数期，其中菌株N14的稳定期为12～14 h，14 h 后进入衰亡期，菌株N16稳定期为12～18 h，18 h后进入衰亡期；菌株N17于2～14 h进入对数期，在14～20 h稳定期后，20 h进入衰亡期；菌株N20在2～10 h为对数生长期，稳定期为10～16 h，16 h以后为衰亡期。

图3 通气条件对固氮菌株生长的影响

图4 固氮菌株典型生长曲线

3 讨论与结论

3.1 温度条件对菌株生长的影响

任何微生物仅能在一定的温度范围内生存，并在适宜温度下大量繁殖，过低的温度会使原生质膜处于凝固状态，营养物质运输受阻，质子梯度难以形成，最终微生物的生长也将停止；而伴随着温度升高，微生物细胞内的化学反应和酶促反应加快，生长速度随之提高[17-19]；然而，当温度升高至某一界限时，微生物体内的蛋白质、核酸或其他细胞成分将会发生不可逆的变性作用，甚至导致微生物细胞死亡[20]。即微生物与其他生物一样，生长温度有着一定的范围且存在着最适生长温度。汤春梅等[21]在研究中测定了燕麦(Avenasativa)和小麦(Triticumaestivun)根际所分离得到的9株促生菌对温度条件的需求与适应能力，结果表明，9株促生菌适应范围很广，在5～45 ℃条件下即可正常生长，但不同菌株最适培养温度条件却不尽相同；黄菊芳等[22]探讨了培养温度对深海热液喷口周围微生物生长繁殖的影响，得出33 ℃为菌株的最适生长温度。与前人的研究相比，本研究供试菌株在20～40 ℃的环境条件下即可正常完成新陈代谢以及繁殖发育，大部分的固氮菌株在25 ℃左右达到生长峰值，培养所需温度更接近常温，所以，如果在工业生产中，固氮菌发酵生产不需要设置特殊的温度来进行，从而可以降低一定的生产成本。

3.2 初始pH值对菌株生长的影响

在微生物培养过程中不适合的初始pH值会在发酵生产的初期就表现出对微生物自身的不利影响，主要是由于氢离子的浓度与营养物质进入微生物细胞体内以及不适合的pH值打破了培养基中离子的化学平衡，降低了培养基中营养成分的浓度[23]。因此，研究寻找有益特定微生物的发酵最适初始pH值，并有效应用在工业培养和发酵生产中，成为相关工业生产中的一项重要措施。李凤霞等[24]分离自燕麦根际的9株PGPR菌株在pH值为7.0时都有很高的固氮酶活性，大部分都超过80 nmol·mL-1·h-1。与其研究结果类似，本研究固氮菌株的最适生长初始pH值为7.0～7.5，表明筛选到的8个功能菌株在中性或稍偏碱性的条件下培养即可达到其生长峰值。所以，对在工业发酵中设置中性或稍偏碱性的pH更加有益于固氮菌的生长。

3.3 通气条件对菌株生长的影响

几乎所有的植物在其生长过程中都离不开氧气，但对微生物来说，对氧气的需要和耐受能力因类群的不同差别很大，一般根据微生物需氧的不同分为专性好氧微生物、兼性厌氧微生物、微好氧微生物以及专性厌氧微生物。通气量可以有效提高菌体培养的生物量，发酵过程需高通氧，即固氮菌B8-G菌株可能为专性好氧微生物[25]；草地早熟禾根际胶质芽孢杆菌的菌株最佳通气量具有一定的差异[16]。在本研究中，各菌株最适通气量的测定结果与前人的研究[16，25]相似，所筛选的菌株最佳通气量并不相同，其中有50%属于专性好氧菌(N4、N5、N10、N16、N17、N20)，N2在通气量为150～200 mL时生长最好，为兼性厌氧菌，菌株N14通气量为100 mL时生长最好，为微好氧菌。故而，在培养过程中要对菌株的需氧量进行测定，以保证菌株的正常生长发育。

3.4 典型生长曲线

本研究把供试菌株接种到液体培养基后，在适宜的温度、pH值、通气条件下，以这些菌株细胞数目的对数值作纵坐标，以培养时间作横坐标，得到了不同菌株的典型生长曲线。根据生成的典型生长曲线可以看出，本研究筛选到的各菌株在生长时都具有比较明显的延迟期、对数期、稳定期及衰亡期。在国内外对菌株生长曲线的测定研究已经有过一定的报道，如对放线菌[26]、酵母菌[27]的生长曲线均进行了研究。在本研究中，不同菌株的典型生长曲线并不相同，绝大部分的菌株在培养2 h后就进入了对数生长期，但它们的对数生长持续时间又有所不同，例如菌株N2、N4在2～16 h后就到达对数生长期，而菌株N14、N16经过延迟期后，于2～12 h时进入对数期；此外，不同的菌株除了对数期持续时间有所不同外，达到稳定期以及最后进入衰亡期的时间及持续时间也不同。这些数据将对菌株的未来生产提供一定的参考依据。

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(责任编辑 武艳培)

Culture condition of nitrogen fixation strains isolated from rhizosphere of Kentucky bluegrass

XU Pei-dong1,2, ZHAO Yan2, ZHANG Xiao-bo1,2, LI Xin-ying3

(1.Key Laboratory of Protectionand Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources (Hainan University), Ministry of Education, Haikou 570228, China；2.College of Agriculture, Hainan University, Haikou 570228, China；3.Agriculture and Animal Husbandry Bureau of Inner Mongolia Ulanqab, Jining 012000, China)

Culture conditions and typical growth curve of eight nitrogen-fixing bacteria strains with strong ability of nitrogenase activity and the solubilizing phosphorus capability isolated from Kentucky bluegrass rhizosphere soil samples were studied. The results showed that the temperature adaptation scope of strains was wide and strains could grow well between 20～40 ℃, with the optimum growth temperature of 25 ℃. The nitrogen fixation strains could grow well in a neutral or slightly alkaline pH condition, with the optimum initial pH range of 7.0 to 7.5. The optimum ventilation volume of strain N4, N5, N10, N16, N17and N20were 220 mL, and the optimum ventilation volume of strain N2and N14were 200 and 100 mL. Based on the above results, the typical nitrogen-fixing bacteria strains growth curves were determined. Most of the strains entered the logarithmic phase after 2 h. Different strains started the lag phase, the logarithmic phase, the stationary phase and the declining phase at different culture time.

Kentucky bluegrass; nitrogen fixation strains; culture condition; typical growth curve

ZHANG Xiao-bo E-mail：angiaoo@126.com

10.11829j.issn.1001-0629.2013-0417

2013-07-29 接受日期：2013-09-03

海南省自然科学基金(312060)

许沛冬(1990-)，男，内蒙古集宁人，在读硕士生，主要从事草坪管理相关研究。E-mail：xuridongshengxpd@163.com

张晓波(1978-)，男，山西岢岚人，副教授，硕导，博士，主要从事草坪管理相关研究。E-mail：angiaoo@126.com

S543.08;S435.4

A

1001-0629(2014)06-1033-06*1