七叶亭对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的调节作用及分子机制研究

李俐

[摘要] 目的 研究七叶亭对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的调节作用及分子机制。方法 离体培养大鼠血管平滑肌细胞，分为高剂量组、中剂量组、低剂量组和对照组。采用MTT法检测细胞的凋亡情况，采用荧光定量PCR检测细胞中Bcl-2、Bax和caspases-9的mRNA含量。 结果 ①细胞凋亡：七叶亭处理后MTT值均低于对照组，且药物剂量越高、MTT值越低；②基因mRNA含量：七叶亭处理后，Bcl-2的mRNA含量低于对照组，Bax和caspases-9的mRNA含量高于对照组；且药物剂量越高，Bcl-2的mRNA含量越低，Bax和caspases-9的mRNA含量越高。结论 七叶亭处理能够诱导大鼠血管平滑肌细胞发生凋亡，且抑制Bcl-2表达和促进Bax、caspases-9表达可能是药物发挥作用的分子机制。

[关键词] 七叶亭；血管平滑肌细胞；凋亡；血管再狭窄

[中图分类号] R719.8 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2015）09（a）-0004-02

Study on the Regulation Effect and Molecular Mechanisms of Esculetin on Rat Vascular Smooth Muscle Cell Apoptosis

LI Li

Department of Cardiovascular Medicine， Huadu District， Guangzhou City People's Hospital， Guangzhou， Guangdong Province， 510800 China

[Abstract] Objective To study the regulation effect and molecular mechanisms of esculetin on rat vascular smooth muscle cell apoptosis. Methods Rats' vascular smooth muscle cells were cultured and divided into high-dose group， middle-dose group， low-dose group and control group. Cell apoptosis was detected by MTT assay. Bcl-2， Bax and caspases-9 mRNA contents were detected by quantitative PCR. Results ①Cell apoptosis： after esculetin treatment， MTT values were lower than control group and the higher the dose， the lower the MTT value； ②mRNA content： after esculetin treatment， Bcl-2's mRNA levels were lower than control group， Bax and caspases-9 mRNA levels were higher than control group； the higher the dose， the lower the mRNA levels of Bcl-2 and the higher the mRNA levels of Bax and caspases-9. Conclusion Esculetin treatment can induce the apoptosis of rat vascular smooth muscle cells and inhibit the Bcl-2 expression and promote Bax and caspases-9 expression， which may play a role in the molecular mechanisms of drugs.

[Key words] Esculetin； Vascular smooth muscle cells； Apoptosis； Vascular restenosis

血管再狭窄是冠心病患者冠状动脉腔内成形术后常见的并发症，会严重影响疾病的预后。近年来的研究认为，血管平滑肌细胞增殖是造成血管再狭窄的重要途径，诱导血管平滑肌细胞凋亡也成为了预防血管再狭窄的重要靶点[1]。七叶亭是一类天然香豆素类化合物，具有诱导肿瘤细胞凋亡、保护心肌细胞缺血再灌注损伤的作用。2012年4月—2014年4月期间该文分析了七叶亭对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的调节作用及分子机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2012年4月—2014年4月期间进行实验，材料如下：雄性大鼠主动脉血管平滑肌细胞株购买于ATCC公司，细胞培养所用的试剂购买于Gibco公司，所用耗材购买于Nunc公司，MTT检测试剂购买于Promega公司，PCR检测试剂购买于Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和处理方法 将冻存的细胞从液氮罐中取出后常规复苏和培养，处理时，七叶亭药物组分别采用100 μM（高剂量组）、50 μM（中剂量组）、10 μM（低剂量组）的七叶亭处理（培养基中含有0.1%二甲基亚砜），溶剂对照组用含0.1%二甲基亚砜的高糖培养基处理。

1.2.2 细胞活力检测方法 细胞处理24 h时，在培养基中直接加入MTT溶液，孵箱中孵育4 h，而后在酶标仪上读取490 nm处的吸光值，参照吸光值计算细胞活力。

1.2.3 基因mRNA含量检测方法 细胞处理24 h时，加入Trizol裂解液后抽提细胞中的mRNA，反转录为cDNA后进行荧光定量PCR反应，分别扩增Bcl-2、Bax和caspases-9，计算mRNA含量。

1.3 统计方法

通过SPSS 18.0软件录入检测所得数据，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析、两两比较采用LSD-t检验，按照P<0.05判断差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞活力

溶剂对照组的MTT值（100.00±16.69），低剂量组的MTT值（65.52±8.72）、中剂量组的MTT值（40.12±6.52）、高剂量组的MTT（18.89±2.42）。方差分析显示，各处理组间的MTT值差异有统计学意义（F=14.852，P<0.05）；LSD法两两比较显示，药物剂量越高、MTT值越低。

2.2 基因的mRNA含量

方差分析显示，各处理组间Bcl-2、Bax和caspases-9的mRNA含量差异有统计学意义（P<0.05）；LSD法两两比较显示，药物剂量越高，Bcl-2的mRNA含量越低，Bax和caspases-9的mRNA含量越高。见表1。

表1 各组间基因的mRNA含量比较（x±s）

3 讨论

冠状动脉腔内成形术是临床常用的冠心病治疗方法，能够取得确切疗效，扩张冠脉管腔、恢复心肌血供。部分患者会在冠状动脉腔内成形术后出现血管再狭窄，进而导致心肌缺血缺氧、病情反复[2]。已有研究显示，在再狭窄的发生和发展过程中，血管平滑肌细胞增殖、迁移以及凋亡不足发挥着重要的调节作用。因此，诱导血管平滑肌细胞凋亡、抑制血管平滑肌细胞增殖是预防冠状动脉腔内成形术后再狭窄的理想靶点[3]。

近年来，临床学者致力于探寻能够促进血管平滑肌细胞凋亡的药物。七叶亭是一类天然香豆素类化合物，为传统中药的有效成份之一，具有广泛的生物学作用[4]。在肿瘤中的研究显示，该药物具有诱导DNA氧化损害以及抑制肿瘤细胞增殖的作用；在心血管系统中的研究显示，七叶亭具有缓解心肌细胞缺血再灌注损伤的作用[5]。基于以上认识，我们推测七叶亭具有预防血管再狭窄、诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用。

在该研究中，研究了七叶亭对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的调节作用及分子机制。MTT法是判断细胞活力最简便的方法，由实验结果可知，七叶亭处理组的MTT值低于溶剂对照组。这就说明七叶亭能够降低大鼠血管平滑肌细胞的活力，诱导细胞凋亡。进一步分析凋亡相关的分子可知，七叶亭处理能够调节凋亡相关基因的表达，且药物剂量越高，Bcl-2的mRNA含量越低，Bax和caspases-9的mRNA含量越高。已有学者报道，Bcl家族蛋白是调节线粒体途径的关键分子，其中Bcl-2属于抗凋亡基因，Bax属于促凋亡基因[6-7]；Caspase-9是Caspase家族中的凋亡执行分子[8]。结合该研究结果及国内学者关于凋亡分子功能的报道[6-8]进行分析可知，叶亭诱导细胞凋亡的分子机制可能是抑制Bcl-2的表达、增加Bax和caspases-9的表达。这一结果是对王志强[5]研究的进一步深入，直接阐明了七叶亭缓解心肌细胞缺血再灌注损伤的分子机制。

综合以上讨论可得出结论：七叶亭处理能够诱导大鼠血管平滑肌细胞发生凋亡，且抑制Bcl-2表达和促进Bax、caspases-9表达可能是药物发挥作用的分子机制。

[参考文献]

[1] 陈洁，熊国祚.血管平滑肌细胞凋亡在血管再狭窄中作用的研究进展[J].临床与病理杂志，2014，34（1）：65-70.

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[3] Cho JH，Shin JC，Cho JJ，et al.Esculetin（6，7-dihydroxycoumarin）： a potential cancer chemopreventive agent through suppression of Sp1 in oral squamous cancer cells[J].Int J Oncol，2015，46（1）：265-271.

[4] 戴榕，郑琼莉，徐全胜，等.七叶内酯对大鼠血管平滑肌细胞增殖的抑制及其机制[J].华中科技大学学报，2009，38（2）：239-242.

[5] 王志强，夏勇.七叶亭预处理对大鼠急性心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J].成都医学院学报，2011，6（1）：49-51.

[6] 马琦，边云飞，白瑞，等.吡咯列酮通过内质网应激致凋亡途径促进大鼠血管平滑肌细胞钙化[J].中国医药指南，2015，13（7）：13-16.

[7] 常亮，付春子，马贤德.补脾益气中药对脾气虚证大鼠血管平滑肌细胞内PDGF、bcl-2、bax表达的影响[J].辽宁中医药大学学报，2011，13（5）：77-78.

[8] 荣晓凤，李荣亨，王维.气虚血瘀证大鼠血管平滑肌细胞 bcl-2及 bax相关凋亡因子的表达[J].中国老年学杂志，2010，30（5）：648-650.

（收稿日期：2015-06-05）