研究分子鉴别诊断在呼吸道感染检测中的应用

黄平 谢名娟 田晶晶

(湖南省常德市第一人民医院 湖南常德 415000)

急性呼吸道感染90%以上是由病毒引起的,其中以呼吸道病毒最常见[1]。它是一种全球范围的常见多发疾病。近年来新发呼吸道传染病如SARS、禽流感及猪流感(H1N1)的爆发和流行,对人类的健康带来巨大的冲击。呼吸道传染病病情复杂,传播速度快,尤其对弱势群体(老年人及婴幼儿)及抵抗能力较差的载体造成极大威胁。呼吸道传染性疾病临床表现相似,较难依靠临床症状诊断。以往的确诊方法为病原体的分离培养,获得结果周期较,且每次实验只能鉴定一种病原体,不能满足快速应急的病原诊断,不利于及时采取措施控制其传播,所以必须将高通量快速检测技术应用于呼吸道病原体的检测,以便为治疗疾病、控制疫情和临床治疗提供可靠依据。

本研究有机结合先进的Tem-PCR(靶序列富集多重PCR)多重扩增技术和液相芯片(xMAP)检测技术,建立常见呼吸道病原体的分子鉴别诊断(MDD)平台,克服了病毒分离培养、血清学诊断及单一PCR的缺点,可以同时检测出多种病毒引起的呼吸道感染。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采集我院呼吸科住院患者呼吸道灌洗液样品5例,咽拭子样品5例。病原体的DNA纯化试剂盒QIAamp DNA Mini Kit和RNA纯化试剂盒QIAamp RNA MiniKit、DNA扩增试剂盒HotStar Taq Master Mix Kit和RNA扩增试剂盒OneStep RT-PCR Kit,以及呼吸道病原体检测试剂盒Resplex I和Resplex II均购自德国Qiagen公司。PCR仪为美国ABI公司的2720 Thermal Cycler,液相芯工作站为德国Qiagen公司Luminex Liquichip200。

1.2 方法

对同一份样品分别纯化DNA和RNA,提取病原体核酸并进行扩增。用Resplex I和Resplex II试剂盒及液相芯片工作站进行PCR产物杂交及检测。

2 结果

2.1 验证MDD检测平台可靠性

用已知阳性样品,经Tem-PCR和杂交后检测,验证整个检测系统的可靠性。用Resplex I检测5种遗传物质为DNA的病原体:ADV细胞培养物、NMG菌液、HFLU菌液、LPN菌液;用Resplex II检测4种遗传物质为RNA的病原体:INFA分离株、INFB分离株、RSV、CEVE。均获得强阳性结果,且有高度的特异性,说明该系统可靠、敏感,能在一次反应对多种病原体进行检测。

表1 以Resplex I对样品中遗传物质为DNA的病原体的检测

表2 以ResplexⅡ对样品中遗传物质为RNA的病原体的检测

2.2 MDD检测平台的应用

以液相芯片和实时荧光PCR仪对未知样品进行检测。对10例临床样品进行检测的结果显示,呼吸道灌洗液阳性检出率高于门诊病例咽拭子样品的阳性检出率,RNA病原体(以病毒为主)的阳性率高于DNA病原体(以细菌为主)的阳性率(表1、2)。部分患者有多种病原体同时感染存在,即有不同种属病原体的共存,也有同一种类不同亚型病原体的共存。这些信息是用常规方法一次实验所根本无法提供的。

3 讨论

急性呼吸道感染绝大多数是由病毒引起的,检测病毒感染的常用方法有:病毒分离培养最为经典,但不利于病毒的快速诊断;血清学诊断较快,但需要已知的特异的抗原或抗体成分,而造成呼吸道感染的病毒有几百种,目前尚不能满足该抗原抗体需求;RT-PCR方法敏感性强、特异性高,在病毒的核酸检测中具有较高的实用价值。但是传统的RT-PCR法通常一次只能从标本中检验出一种病毒,对于尚不明确的病毒感染无异于大海捞针。xMAP技术平台是一种高效的分子检测手段,它的灵敏性、特异性及可重复性都得到了很好的验证[2]。在本研究中,我们将一种新型的Tem-PCR扩增技术和xMAP技术整合在一起,整个检测可在4h左右完成。

MDD检测系统具有多重性,提高了病毒的检出率,在一次检测过程中,可对多种呼吸道感染的病原体同时检测,达到快速诊断、指导治疗的目的[3]。从而克服常规PCR的局限性,同时具有高效、敏感、特异特点,信息量大,可用于对呼吸道致病病原体的快速初筛,对不明原因发热为主要特征的呼吸道症候群协助诊断。

[1]张梓荆.小儿病毒性呼吸道感染与病毒性肺炎[M].北京:中国医药科技出版社,1990:4.

[2]Inanone MA.Mierosphere-based molecular cytometry[J].Clin Lab Med,2001,21:731～742.

[3]Spiro A,Kowe M.Qunatitation of DNA sequences in environmental PCR products by a multiplexed bead-based method[J].Appl Environ Micmbiol,2002,68:1010～1013.