不同贮藏温度对2种冬青花粉萌发力的影响

郑永强,芦 斌,洪春桃,魏 斌,沈登锋,章建红,潘存德

(1.新疆农业大学林学与风景园林学院,新疆 乌鲁木齐 830052;2.宁波市农业科学研究院林业研究所,浙江 宁波 315040)

冬青属(Ilex)植物株型优美,果色鲜艳,果量大,属内有铁冬青(Ilexrotunda)、无刺枸骨(I.cornuta′Fortunei′)等在园林中广泛应用[1]。系统进化研究表明,冬青属植物种间存在广泛的基因交流和遗传渐渗,种间生殖隔离不明显。在冬青属植物间开展杂交育种,聚合不同种间的优良性状具有天然优势。但由于冬青属植物品种繁多,在杂交育种中经常会有花期不遇的情况。开展花粉贮存条件的研究,可以有效地解决这一问题。

花粉作为杂交育种的重要基础材料,具有丰富的遗传变异,是新种质创制的关键[2]。常用的花粉贮藏方法主要为低压法、低温干燥法、冷冻干燥法和超低温法等[3-6]。以上贮藏方法主要通过温度、空气湿度等条件的调控抑制花粉呼吸作用,延长花粉活力。其中效果最佳的是超低温贮存法,其常用于菌株、酶、DNA等生物活性物质的保存,且用于花粉贮存的研究比较全面[5-6];冷冻干燥贮存法与低温干燥贮存法区别在于需要更低的温度和湿度,一般于-20 ℃左右贮存,比较经济、简便,应用广泛。不同贮藏温度对于不同种花粉的影响存在差异,且活力变化曲线也存在差异[7-9]。因此,本文对全缘冬青(I.integra)和枸骨2种乡土冬青属植物的花粉萌发和贮藏温度进行研究,以期解决由遗传差异造成的不同种间花期不遇而影响杂交育种的问题,为冬青杂交育种中花粉活力检测及保存提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验地位于宁波市农业科学研究院高新农业技术试验园区(121°41′E、29°48′N),属亚热带季风气候,夏季高温多雨,冬季寒冷干燥,全年降水量充沛。以园区内全缘冬青和枸骨15 a植株的花粉为试验材料。选择在盛花期(2022年3月24日)进行花粉采集,用修枝剪剪取生长健康、花朵发育良好、花量大的雄花枝,带回实验室置于阴凉干燥处水培,于25日7∶00使用镊子、毛刷和毛笔等工具将待开放或刚开放的雄花置于铺有硫酸纸的培养皿中收集花粉,然后置于2 mL的离心管中存放,至8∶00采集结束,并分成4份。

1.2 试验方法

参阅文献[7-10],采用离体萌发法,设置4种花粉贮藏温度[7,10-13],即室温(20～23 ℃)、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃ 4种贮藏温度处理;并根据花粉活力变化速度设置观测点时间,详见表1。

表1 不同处理花粉测定时间

花粉活力测定方法:采用优化后的培养基配方,蔗糖100 g·L-1+硼酸10 mg·L-1+琼脂0.5%,将pH值调至7.0[13-14]。用玻璃棒蘸取少许融化后的培养基,均匀涂抹在双凹载玻片的凹陷区域,用毛笔蘸取充分混合后的花粉,均匀撒播于培养基表面。将玻片置于铺有2层湿滤纸的培养皿中,外部包裹锡纸避光处理,放入28 ℃的培养箱中培养24 h,使花粉管充分萌发。

花粉管充分萌发后,用40×显微镜观察(蔡司Axio Scope.A1),统计花粉萌发率和评价花粉活力。花粉管萌发长度大于或等于花粉粒直径作为判断花粉萌发的标准[8,10-11]。每个载玻片取5个视野计数;萌发率计算公式为:萌发率(%)=已萌发的花粉粒数 / 测定的花粉粒总数×100。

1.3 数据处理

数据采用Excel 2021计算和分析,利用Origin pro 2021进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同贮藏温度对枸骨花粉萌发率的影响

新鲜枸骨花粉的初始萌发率为89.1%。由图1可知,在4种温度条件下贮藏的枸骨花粉,其萌发率随着时间的延长均呈现不同程度的下降。在室温条件下贮藏3、7 d时萌发率分别为79.3%、44.1%,基本可以满足短期内的生产需求。在4 ℃条件下,贮藏4～7 d的萌发率在71.6%～60.4%之间,均高于室温保存;但却在贮存14 d后迅速下降,16 d时达到最低值(12.6%)。-20 ℃低温贮藏下,花粉萌发率在120 d内保持着较高的萌发率水平;但在贮藏140 d时迅速下降,萌发率从60.8%(30 d)降至4.4%(140 d),无法满足育种需要。-80 ℃超低温贮藏,60 d时萌发率为63.54%,显著低于初始萌发率;然后缓慢下降至130 d时的33.58%;之后花粉萌发率急剧下降至140 d时的2.87%。

不同小写字母为在相同温度贮藏条件下不同时间萌发率差异显著,下同。

对比枸骨花粉在4种贮藏温度下随着贮藏时间变化的萌发率可以看出,贮藏于-20 ℃和-80 ℃条件下花粉活力长时间保持较高活力,在这2种温度条件下贮藏枸骨花粉可以有效减少花粉萌发力下降,延长花粉贮藏时间。

2.2 不同贮藏温度对全缘冬青花粉萌发率的影响

全缘冬青新鲜花粉的初始萌发率为86.1%。由图2可知,在4种温度条件下贮藏的全缘冬青花粉,其萌发率随着时间的延长均呈现不同程度的下降。贮藏在室温下的花粉在第6 d时已下降至15.7%,基本失去应用价值。在4 ℃低温条件下贮藏4 d时花粉萌发率为71.9%,显著低于初始萌发率;至16 d时萌发率下降至14.6%,显著低于相同温度条件下其它时间的萌发率。-20 ℃贮藏条件下,贮藏30 d时花粉萌发率为68%,显著低于初始萌发率;贮藏60、90、110 d时花粉萌发率分别为54.3%、51.4%、42.8%,下降较为缓慢;至140 d时花粉萌发率为4.01%,下降速度较快。-80 ℃贮藏条件下,贮藏60、110 d时萌发率分别为55.3%、44.2%,显著低于初始萌发率;至140 d花粉萌发率为2.97%,基本失去生活力。

图2 全缘冬青花粉不同贮存温度萌发率的变化情况(A:室温;B:4 ℃;C:-20 ℃;D:-80 ℃)

全缘冬青花粉萌发率在不同贮藏温度条件下的下降趋势总体与枸骨相同。不同的是,在室温条件下全缘冬青花粉贮藏6 d时萌发率就达到极低的水平,枸骨则是在7 d时仍有较高的萌发率;但全缘冬青在贮藏90 d后出现-20 ℃条件下的花粉萌发率均高于-80 ℃的现象,如贮藏120、130 d时,-20 ℃条件下贮藏的萌发率分别为36.3%、32.6%,-80 ℃条件下贮藏的萌发率分别为29.4%、27.1%,说明全缘冬青花粉较适合在-20 ℃条件下贮藏。

3 结论与讨论

冬青不同种间的花期差异较大,如贝尔奇卡金(I.×altaclerensis′Belgica Aurea′)、牢苏尼阿纳(I.×altaclerensis′Lawsoniana′)、金皇帝(I.×altaclerensis′Golden King′)3种哈克勒雷冬青的盛花期较枸骨、全缘冬青晚10～15 d,在3月底或4月初左右,如进行杂交育种,则会碰到花期不遇的问题。从本试验结果来看,常温储藏下枸骨和全缘冬青只能在3 d内保持较高的花粉活力水平。李修鹏等[11]和吴月亮等[12]研究发现华顶杜鹃(Rhododendronhuadingense)和文冠果(Xanthocerassorbifolia)的花粉常温贮藏时的生活力均不能满足实际生产需求,与本试验结果相类似。

研究表明,低温贮藏对于保持花粉活力具有重要作用。李振勤等[8]研究表明相同时间下低温冷藏保存的滇山茶(Camelliareticulata)花粉萌发率显著高于常温保存,且梅红品种的花粉萌发率随着保存温度的下降而显著上升;4个桑树品种花粉研究也有同样的趋势,花粉活力是随着储藏温度的降低而升高[15]。本研究结果表明,在4 ℃低温条件下贮藏的2种冬青的花粉保存时间仅16 d,-80 ℃条件下的枸骨花粉和-20 ℃条件下的全缘冬青花粉贮藏90 d时萌发率均在50%以上,3种低温条件下的花粉萌发率显著高于室温,这与李振勤等[8]的研究结果相一致。但是在贮藏90 d后,全缘冬青表现出-80 ℃贮藏的花粉萌发率低于-20 ℃的情况,与李振勤等[8]和陈怡等[15]的研究结果(花粉保存活力是随着储藏温度的降低而升高)不一致,这可能与物种或花粉对于温度剧烈变化的敏感性有关。本研究中2种冬青花粉萌发率比郭娟等[10]研究的4种冬青(短梗冬青(I.buergeri)、全缘冬青、大别山冬青(I.dabieshanensis)、大叶冬青(I.latifolia))采用离体萌发法在4、-20 ℃条件下的萌发率都要高,比李修鹏等[11]研究的华顶杜鹃的萌发率要低,表明花粉的保存期限也因植物种类和贮藏条件的不同存在较大差异[12],且充分说明贮藏温度是影响花粉萌发力的重要因素[16]。因此,虽然在室温条件下2种冬青花粉均不能保存较长时间,仅可用于花期邻近(相差3 d以内)物种的杂交育种;在生产应用上短期(30 d)保存2种冬青都可以采用-20 ℃低温贮藏;长期(60～90 d)保存,枸骨采用-80 ℃低温贮藏,全缘冬青可采用-20 ℃低温贮藏。考虑到实际具备条件和能耗问题,建议均选择-20 ℃低温保存。