朱缨花抗氧化物质含量及花青素组分分析

李成悦，陈丽芳，范 全，贺朋飞，邱栋梁

(福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002)

朱缨花(CalliandrahaematocephalaHassk.)俗名：红合欢、美蕊花、红绒球、美洲合欢，原产于南美，如今在我国福建、广东、台湾等地有引种。朱缨花喜光，生长茂盛，头状花序腋生，花丝离生部分鲜红色，雄蕊管白色，株形紧凑，并且花型独特酷似一团绒球，花期长，花色绚丽，在盛花时节满树红花；并且叶片可以吸收空气中硫氧化物，起到净化空气、美化环境的作用；是冬季园林绿化中一类优良木本观赏花卉[1-3]。

花青素是一类水溶性色素，存在于植物花瓣、果实等部位，属于多酚类化合物中类黄酮物质[4]。花青素在食品工业中被称为人体第7大必需营养素[5]。目前已知有20种花青素，常见的花青素种类有矢车菊素、飞燕草素、天竺葵素、牵牛花素、锦葵素和芍药花素等，若花瓣呈现红色或粉红色说明矢车菊素含量较高，呈现橙红色说明天竺葵色素含量较高，若呈现蓝色表明飞燕草色素含量较高[6-9]。目前，有关朱缨花花青素组分分析的研究较少。本研究旨在探究不同时期朱缨花花青素组分变化以及总酚和类黄酮含量变化，以期为提高朱缨花的使用价值提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

朱缨花均采自福建农林大学校园。随机从植株的东、西、南、北各个方向采取健康生长处于花蕾期、盛花期、末花期的花朵各30朵，3次重复。不同时期朱缨花采样标准见图1：花蕾期的花苞闭合，处于显色状态(图1a)；盛花期花朵花丝离生部分呈鲜红色，其荚果线状倒披针形，由顶至基部沿缝线开裂，果瓣外反(图1b)；末花期花丝卷曲成团，颜色加深(图1c)。

图1 不同时期的朱缨花

1.2 含水量的测定

随机选取花蕾期、盛花期、末花期的新鲜花30朵，单个样品取样量为3 g，其质量记为M1，放入60 ℃烘箱中48 h烘干至恒重取出用电子天平测其重量记为M2。花朵含水量(%)=(M1-M2)/M1×100。

1.3 总酚含量测定

1.3.1 样品提取液制备 新鲜花朵经液氮研磨后用分析天平准确称取粉末0.5 g，将研磨充分的样品倒入离心管中，加入2%的盐酸甲醇溶液10 mL，超声30 min后，4 ℃避光浸提24 h、11000 r·min-1条件下离心10 min，上清液即为提取液。每个处理3次重复。

1.3.2 标准曲线绘制 参考刘霞等[10]的测定方法，配制质量浓度分别为 20、40、60、80、100 μg·mL-1的没食子酸标准溶液。取上述标准溶液各1 mL于离心管中，加入福林酚试剂0.5 mL和去离子水4 mL，摇匀后反应5 min，加入7%Na2CO3溶液1 mL，室温下避光放置2 h后，用UV5100H紫外分光光度计在765 nm波长处测定其吸光值。以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.3 样品测定方法 分别取样品溶液0.1 mL置于试管中，按1.3.2的方法处理后测定其吸光度；根据标准曲线，计算样品干重的总酚含量(以每克朱缨花中含有没食子酸的毫克数来表示)。

1.4 类黄酮含量测定

1.4.1 标准曲线绘制 参考孙月婷等[11]有关类黄酮含量测定方法，配制质量浓度分别为0.4、0.8、1.2、1.6、2 mg·mL-1的芦丁标准溶液。吸取芦丁标准溶液各0.2 mL置于试管中，加入5%NaNO3溶液0.12 mL，震荡混匀后静置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液0.24 mL，震荡混匀后静置 6 min，后加入0.8 mol·L-1NaOH溶液，用0.44 mL双蒸水稀释；用UV5100H紫外分光光度计在510 nm处测定吸光度。以芦丁质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.4.2 测定方法 取样品提取液各0.4 mL于试管中，加入蒸馏水2 mL，按1.4.1的方法处理后测定吸光度，根据标准曲线方程，计算干重的类黄酮含量(以每克朱缨花中含有芦丁的毫克数来表示)。

1.5 花青素含量测定

1.5.1 总花青素含量测定 参照魁小花等[12]的测定方法，取样品提取液2 mL于试管中，用水稀释至4 mL，震荡摇匀。以2%甲醇盐酸作为对照，用UV5100H紫外分光光度计在520nm处测定吸光度。计算朱缨花干重的花青素含量。

1.5.2 花青素各组分含量测定 参照钱大伟等[13]的测定方法，将制备的飞燕草素葡萄糖苷(Dp)、锦葵素-3-O-葡萄糖苷(Mv)、矢车菊素-3-葡萄糖苷(Cy)、芍药素葡萄糖苷(Pn)、天竺葵素-3-氯化葡萄糖苷(Pg)等标准品溶液，用LC-100高效液相色谱仪测定液相图谱标识峰面积。以标准溶液的浓度为横坐标，液相图谱标识峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

将样品提取液经过0.22 μm滤膜过滤后在色谱条件下进行测定。进样量：20 μL；色谱柱C-18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；色谱条件：流动相A为水∶甲酸∶乙腈=40∶10∶50(体积比)，流动相B为水∶乙腈∶甲酸=87∶3∶10(体积比)，柱温38 ℃，检测波长520 nm，流速1 mL·min-1，梯度洗脱条件为：①0～15 min：6%～30% A；②15～30 min：30%～50% A；③30～35 min：50%～60% A；④35～40 min：60%～6% A。

1.6 统计与分析

采用Excel 2010和GraphPad进行数据整理和作图；应用LC-WS100色谱工作站软件进行HPLC图谱绘制；利用IBM SPSS Statistics v26.0软件的Duncan多重比较法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同时期朱缨花含水量的变化

不同小写字母为差异显著(P<0.05)， 下同。 图2 朱缨花不同时期含水量图

朱缨花不同时期含水量的变化见图2。盛花期含水量最高，达46%；末花期的含水率最低，仅17%；两者差异达显著水平(P<0.05)。

2.2 朱缨花类黄酮及总酚含量比较

从图3可知，总酚含量随着花朵衰老呈下降趋势，花蕾期总酚含量显著高于盛花期、末花期，末花期总酚含量显著降低。类黄酮含量随着花朵衰老呈上升趋势，在花蕾期、盛花期含量低，末花期含量显著上升。

图3 朱缨花类黄酮及总酚含量

2.3 朱缨花花瓣花青素组分及含量比较

由图4可知，3个时期(花蕾期、盛花期、末花期)均在7、9、11、13、15 min左右开始出现单一高峰，这与标准品检测到的时间相符合。对不同时期花青素含量进行比较分析(图5 a)可知，不同时期的花青素含量差异显著(P<0.05)；末花期花青素含量均高于花蕾期、盛花期。采用HPLC对其花青素成分及含量进行分析(图5b)可知，矢车菊素是最主要的花青素组分，其花蕾期含量为118.42 μg·mL-1，占总花青素的70.77%，而天竺葵素、锦葵素、芍药素、飞燕草色素含量分别为19.88%、3.51%、2.57%、3.3%；盛花期矢车菊素含量为86.39 μg·mL-1，占总花青素的67.43 %，天竺葵素、锦葵素、芍药素、飞燕草素含量分别占花青素的25.62%、2.12%、2.52%、2.32%；末花期矢车菊素含量为122.14 μg·mL-1，占总花青素的59.85%，天竺葵素、锦葵素、芍药素、飞燕草素含量分别占花青素的23.48%、4.68%、3.60%、3.05%。

3 结论与讨论

花青素的生物活性较强，属于天然食用色素，花色素清除DPPH和OH-自由基能力优于Vc，清除ABTS+自由基的能力与Vc相当[14]。本试验结果表明，盛花期的花青素含量显著低于花蕾期，可能在花苞形成早期已完成花青素的合成，花朵开放速度比花青素合成的速度快，且含水量显著上升的结果。末花期花青素含量显著高于盛花期，可能是随着花朵衰老期含水量减少，花青素浓度呈上升趋势。这与崔虎亮等[15]关于不同牡丹品种花期总花青素含量不断积累，在衰败期时达到最高的研究结果相一致，也与刘安成等[16]关于‘火焰’忍冬开花过程中冬末花期的总花青苷含量仍高于初花期的研究结果一致。

Dp为飞燕草素葡萄糖苷；Cy为矢车菊素葡萄糖苷；Pg为天竺葵素葡萄糖苷；Pn为芍药素葡萄糖苷；Mv为锦葵素葡萄糖苷；下同。图4 不同时期朱缨花花青素高效液相色谱图

图5 朱缨花干重时总花青素含量及组分

类黄酮化合物普遍存在于植物发育和防御过程，近年来在抑菌、抗氧化、清除自由基等药理功能受到人们广泛关注[17]。朱缨花末花期类黄酮的含量显著高于盛花期以及花蕾期，推测在花青素积累的同时类黄酮含量增加的增色效应是其末花期花的颜色加深的主要原因。总酚含量随着花朵的开放呈下降趋势，3个时期总酚含量差异达到极显著水平，这与植物酚类物质具有清除自由基，抗氧化抗衰老的作用，且随着花朵枯萎含水量下降，植物内总酚含量呈逐渐下降趋势相关。

开发和利用天然色素对保护人类身体健康具有重要意义，并在食品、医药、化妆品等行业具有广阔前景[18]。矢车菊素属于天然食用色素，具有抗炎、抗癌、抗氧化、预防糖尿病、抑制肿瘤生长、保护心脏、增强血液循环和保护感受器细胞等作用[19-22]；矢车菊素增加肝细胞的抗氧化性，从而降低脂肪变性所引起的细胞氧化损伤[23]。从不同时期朱缨花花青素组分可以看出，矢车菊素是朱缨花最主要的花青素组分，因此今后从基因、分子等角度研究朱缨花色素的形成机制，对于增加朱缨花观赏性及开发天然矢车菊素有重要的意义。

综上所述，朱缨花中共检测到5种花青素组分，分别是矢车菊素、天竺葵素、飞燕草素、芍药素和锦葵素，矢车菊素为朱缨花中花青素的主要组分。花青素含量末花期最高，花蕾期的总酚含量最高，末花期的类黄酮含量最高。