福建省两栖类新记录——粤琴蛙

黄雅琼，李文周，陈 斌，蔡孝星，郑志学，吕植桐

(1.福建戴云山国家级自然保护区管理局，福建 德化 362500；2.中山大学生命科学学院，广东 广州 510275)

蛙科(Ranidae)琴蛙属(Nidirana)物种广泛分布于东亚和东南亚的亚热带地区，目前该属共有已知物种14种，且所有已知种在我国均有分布[1]。弹琴蛙(N.adenopleura)是琴蛙属中命名较早的物种之一，曾经是该属中分布范围最广的物种，被广泛记录于我国华东、华南、西南等地[2]。近年来，随着分子生物学技术的发展及综合分类法的应用，原先曾被鉴定为弹琴蛙的多个不同种群，先后被发表为新物种[1，3-4]。其中，分布于广西大瑶山的种群被认定为瑶琴蛙(N.yaoica)，分布于贵州雷公山和梵净山的种群被认定为雷山琴蛙(N.leishanensis)，分布于湖南湘江流域的种群被认定为湘琴蛙(N.xiangica)，分布于浙江北部的种群被认定为孟闻琴蛙(N.mangveni)，分布于广东北部、湖南东南部和江西西南部的种群为粤琴蛙(N.guangdongensis)。

分布于福建省的琴蛙种群，此前也均被鉴定为弹琴蛙[2，5-6]。此后，经过形态比较和分子系统发育分析研究，福建北部的种群被确认为是真正的弹琴蛙[1，7]，而福建南部的琴蛙种群目前仍缺乏相关厘定。2017年6月，在福建戴云山国家级自然保护区采集到4号琴蛙属标本，经过详细的形态比较和分子系统发育分析鉴定为粤琴蛙，为福建省两栖类新记录。本发现为琴蛙属的系统学和谱系地理学研究提供重要信息。

1 材料与方法

1.1 材料

4号琴蛙标本是2017年6月26日夜晚徒手采集自福建戴云山国家级自然保护区九仙山(118°06′44.20″E、25°41′39.96″N)。标本安乐死后，剪取大腿腹侧肌肉样品保存于95%乙醇中；标本用5%福尔马林溶液固定定型后转移至70%乙醇溶液中，保存于中山大学生物博物馆(SYS)。

1.2 形态鉴定与测量

使用游标卡尺对4号标本的形态特征进行测量，精确到0.1 mm。测量标准及形态特征鉴定均依照 Lyu 等[1]的定义。

1.3 DNA提取、PCR扩增和测序

使用Tiangen Genomic DNA Kit试剂盒提取样品的基因组DNA(方法参照其说明书)，提取的DNA溶液保存于-20 ℃备用。利用PCR扩增线粒体COⅠ基因片段。扩增引物参照Lyu等[1]的 dgLCO (5′-GGTCAACAAATCATAAAGAYATYGG-3′) 和dgHCO(5′-AAACTTCAGGGTGACCAAARAAYCA-3′)，反应条件为95 ℃预变性4 min，随后以94 ℃变性40 s、52 ℃退火40 s、72 ℃复性1 min进行35个循环，最后72 ℃补充延伸10 min。PCR 产物进行双向测序，所得序列用于系统发育分析。

1.4 序列分析及分子系统树的构建

从GenBank数据库下载琴蛙属部分物种及其近缘类群拇棘蛙属(BabinaThompson)，1912物种的相关COⅠ基因序列(表1)。拇棘蛙属物种作为构建分子系统树的外群[7]。所有序列在MEGA 6.0软件[8]中使用Clustal W算法[9]进行序列比对，采用默认参数。比对后的序列在jModelTest v2软件中基于AIC标准计算最佳核苷酸替代模型；用MEGA 6.0 软件的p-distance距离模型计算各物种间的遗传距离；使用RaxmlGUI 1.3软件[10]，采用最大似然法(maximum likelihood，ML)构建ML系统发育树，并进行1000次bootstrap重复抽样分析以检验系统发育树各节点置信度。

表1 所有样品的采集信息、标本凭证和GenBank序列号

续表1

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定及比较

采集自福建戴云山国家级自然保护区的4号琴蛙标本为3雄1雌(图1)，所有标本的形态量度结果见表2，其形态符合粤琴蛙的鉴定特征。

A1.雄性背面；A2.雄性腹面；B1.雌性背面；B2.雌性腹面

体型大，雄性头体长53.1～53.6 mm，雌性头体长56.6 mm。头长大于头宽；吻端钝圆，突出于下唇，吻长大于眼径；吻棱明显，颊部向内略微凹陷；鼻孔位于吻、眼之间，略近于吻端；眼间具显著松果体；眼间距小于鼻间距；鼓膜清晰，小于眼径，接近眼；不具颞褶；具犁骨棱和犁骨齿；舌末端具缺刻。雄性具一对咽下外声囊。

前肢较粗壮；指细长，指序为Ⅱ<Ⅰ<Ⅳ<Ⅲ；指末端略膨大成吸盘，除I指外均具腹侧沟；无蹼，Ⅰ指外侧及Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ指内外侧具显著缘膜；关节下瘤显著，各指基部具不明显的指基下瘤；掌突3个，椭圆形、大而显著。雄性第I指基部背面具单个婚垫，无婚刺。

后肢相对粗壮，后肢前伸贴体时胫跗关节达鼻孔，跟部重叠；趾细长，趾序为Ⅰ<Ⅱ<Ⅴ<Ⅲ<Ⅳ；趾末端略膨大成长而尖的吸盘，各趾均具显著腹侧沟；脚蹼中等大小，蹼式：Ⅰ1～2Ⅱ1～2Ⅲ1～3Ⅳ 3Ⅴ～1V；各趾内外侧均具显著缘膜；关节下瘤显著；内蹠突椭圆形，长约为宽的3倍；外蹠突不显著，小而圆。

表2 福建戴云山国家级自然保护区度量粤琴蛙标本的形态度量

背部皮肤粗糙；后背部及后肢密被锥状角质刺，头部及体背具稀疏的角质刺；背侧褶发达，自上眼睑后缘延伸至腹股沟上方，末端断断续续，具稀疏角质刺；雄性体侧粗糙，具小疣及稀疏角质刺，具显著、光滑、略微凸起的肩上腺；雌性体侧较光滑，不具角质刺，不具肩上腺。腹面光滑，腿后部及肛周围具扁平疣。

生活时背面棕红色，角质刺白色；松果体黄色；背部具断续的黄色背中线，自松果体延伸至肛部上方；体侧上部灰褐色，下部浅黄色，肩上腺米黄色。前肢浅褐色，具黑色条纹；后肢深褐色，具黑色横纹。颊部及颞部棕色，鼓膜浅褐色；虹膜上1/3浅褐色、下2/3红棕色。腹面白色；雄性咽部粉色。

2.2 分子系统发育关系

PCR扩增获得福建戴云山国家级自然保护区琴蛙线粒体COⅠ基因序列4条，长度各569 bp。用于系统发育分析的最佳核苷酸替代模型为GTR+G+I。最大似然系统发育树(图2)显示，采自福建戴云山自然保护区的琴蛙标本与广东北部、湖南东南部、江西西南部的粤琴蛙样品聚为支持率较高(99%)的单系群，而与福建北部、江西中部、浙江南部、台湾的弹琴蛙样品亲缘关系甚远。基于p-distance距离模型估算的遗传距离(表3)显示，福建戴云山国家级保护区的琴蛙种群内部遗传距离为0.1%；与广东北部、湖南东南部、江西西南部的粤琴蛙种群遗传距离为1.8%，略大于该种群内部的遗传距离(1.3%)；与弹琴蛙的遗传距离为9.4%。分子系统发育分析结果支持福建戴云山国家级自然保护区的琴蛙标本为粤琴蛙，而非原文献记录的弹琴蛙[2，5-6]。

表3 基于线粒体CO Ⅰ基因的琴蛙属物种间p-distance遗传距离

表3(续)

分支末端数字为样品序号，节点上的数字为最大似然法自举值

3 讨论

粤琴蛙为2020年新发表的两栖动物新物种，在此之前已知的分布范围为广东北部、湖南东南部、江西南部的南岭山脉中段及罗霄山脉南部[1]。本次在福建中部的戴云山国家级自然保护区报道该物种的新分布，是福建省两栖类新记录。这一发现，将粤琴蛙的分布区域向东扩展至福建中部(图3)。此前，福建北部、江西中部的琴蛙种群已被确认为弹琴蛙[1，7]。因此，可以推测从广东北部沿南岭山脉、莲花山脉往东的闽南、粤东、赣南等地此前记录的弹琴蛙种群也应该是粤琴蛙。在这些地区需要进行全面和详细的调查，以了解这一新物种确切的分布范围及种群状况。

戴云山国家级自然保护区位于福建中部的戴云山脉，其北部为福建最大河流闽江。目前已经报道确认过的福建北部的弹琴蛙种群[1，7]，均分布于闽江以北；而此次报道的粤琴蛙种群分布于闽江以南的戴云山。这也表明，闽江可能是弹琴蛙和粤琴蛙2个物种在福建省内分布区的分界线。

星形为福建戴云山国家级自然保护区；红色圆形为此前报道的粤琴蛙分布点；黑色圆形为此前报道的弹琴蛙分布点；右上方小图为福建戴云山国家级自然保护区粤琴蛙生境。

*：感谢福建戴云山国家级自然保护区管理局赖钟俊、陈文伟、徐荣地、陈亚婷，中山大学王英永、王健协助完成室内实验、野外调查工作，并对本论文提供了宝贵建议和帮助。