高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法测定消字号乳膏中8种抗真菌药物

时间：2024-07-28

赵丽红路亚静李忠华

（太原市食品药品检验所山西太原 030001）

1 前言

抗真菌药物为抑制或者杀灭致病真菌的药物，按其作用特点分为抗浅部真菌药、抗深部真菌药、对深部和浅部真菌感染均有效药物等[1]。治疗真菌感染疗程较长，疗程不足则易复发[2]；滥用或长期使用抗真菌药物会产生耐药性，危害患者身体健康[3-5]。

消字号乳膏为消毒类产品，消毒产品生产企业卫生规范（2009年版）[6]第30条明确列出“消毒产品禁止使用抗生素、抗真菌药物、激素等物料”。部分不法商家利益至上，为提高产品疗效、增加销量，在此类产品中添加抗真菌药物，从而造成消费者经济损失及健康损害。2019年，国外期刊柳叶刀发表了“消字号”产品中检出抗真菌药物的文章[7]，国内新闻媒体中也常有相关报道。本文建立了HPLC-MS/MS法测定“消字号”乳膏基质中8种常见抗真菌药物的检验方法，并对网络平台及实体店购买的“消字号”乳膏进行了测定，为市场监管提供技术参考作用。

2 材料与方法

2.1 仪器

三重四极杆液质联用仪（岛津公司，LCMS 8050）；色谱柱：shim-pack XR-ODS 2.0×100 mm，2.2μm；MS105DU电子天平（瑞典梅特勒-托利多公司）；XPE304电子天平（瑞典梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。

2.2 试剂

甲酸（LC-MS级，日本TCI公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Merk公司）；灰黄霉素、克霉唑、联苯苄唑、萘替芬、酮康唑、益康唑等6种标准品购于BePure公司；硝酸咪康唑、盐酸特比萘芬2种标准品购自中国食品药品检定研究院。实验所用样品购于网络平台及山西省太原市某些实体店。

2.3 标准溶液的配置

标准储备液：将上述8种标准品分别配置成100 μg/mL的标准储备液，于-18℃避光密封存储（有效期3个月）。

混合标准储备中间液：准确吸取上述2组混合标准储备液各1 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得1μg/mL的混合标准储备液（有效期1周）。

混合标准工作溶液：准确吸取一定体积的上述混合标准储备中间液于10 mL容量瓶中，乙腈定容，制得0.5、1、2、5、10、20、50 ng/mL的混合标准工作溶液（临用现配）。

2.4 样品前处理

取0.5 g样品至50 mL具塞试管中，加入乙腈少量，涡旋震荡分散，再加入乙腈至35 mL，超声提取15 min，放冷至室温，定容。冰浴放置2 h后迅速滤过，即得。

2.5 LC-MS/MS检测条件

流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液.所采用的梯度系统程序如下：0～5.5 mim，20%～65%B；5.5～6.5 mim，65%～95%B；6.5～7.5 mim，95%B；7.5～7.6 mim，95%～20%B；7.6～10 mim，20%B。流速：0.3 mL/min；柱温：35℃；进样体积：1μL。

质谱条件：ESI源；雾化气流量3 L/min；加热气流量10L/min；干燥气流量10 L/min；接口温度300℃；扫描方式为多反应监测模式（MRM）。8种抗真菌药物的保留时间、离子对、碰撞能量等相关参数见表1。

表1 8种抗真菌药物的LC-MS/MS分析参数

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的优化

比较了C18和C8 2种色谱柱的分离效果，在相同的流动相条件下，采用C18色谱柱时化合物的分离效果及峰型优于C8色谱柱，且C18色谱柱更通用，故选择C18色谱柱进行该项研究。比较了0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇、0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈为流动相时化合物出峰情况，后者系统压力低、峰型好、响应高，选其作为该项研究的流动相。

3.2 提取方法的选择

查阅上述8种抗真菌药的化学性质、含量测定方法后[8-10]，初步确定以甲醇、乙腈为提取溶剂进行研究。回收率结果显示：甲醇为提取溶剂时，灰黄霉素及酮康唑的提取率低且平行样相对误差大。研究过程中还发现，部分乳膏基质的甲醇或乙腈提取液滤膜过滤后，在室温较低时，存在基质析出的情况，本实验将处理好的样品冰浴放置2 h后，促使乳膏基质析出，并于温度未上升时迅速滤过，从而减少了液质上机测试的干扰。

3.3 基质效应的考察

基质效应（Matrix effect，ME）是UPLC-MS/MS法中影响定量结果准确性的重要因素[11-13]，可采用（基质标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率－1）×100%进行评价，正值表示存在基质增强效应，负值则表示存在基质抑制效应。|ME（%）|≤20%，认为基质效应弱，可忽略；20%<|ME（%）|≤50%为中等基质效应，|ME（%）|＞50%，表明基质效应很强[14]。由表2可知，8种抗真菌药物在所测试的乳膏中基质效应均小于20%，以弱的基质抑制效应为主，且抗真菌药物需达到一定剂量才能发挥药效，其添加量一般很大（见表3），至少需稀释上千倍，而溶剂稀释可进一步减弱LC-MS/MS法中基质效应[14-15]，故本方法中可直接用溶剂标准曲线进行校正。

表3 10批次样品中8种抗真菌药物的检测结果

3.4 方法学考察

配制0.5、1、2、5、10、20、50 ng/mL的混合标准工作溶液，在优化好的条件下进行上机测试，以待测抗真菌药物质量浓度（x，ng/mL）为横坐标，相应的定量离子对峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明：在0.5～50 ng/mL的质量浓度范围内，上述8种抗真菌药物的r值均大于0.99，线性关系良好。分别以3倍信噪比和10倍信噪比计算其方法检出限和定量下限，检出限为0.03～0.07 mg/kg，定量下限为0.10～0.20 mg/kg，具体数据详见表2。

表2 8种抗真菌药物的线性方程、相关系数、回收率、相对标准偏差、检出限、定量限及基质效应

取0.5 g空白基质至50 mL具塞试管中，加入混合标准品适量，放至80℃水浴中，待基质呈均一液态时取出，室温下基质自动恢复半固体状。加入乙腈适量，涡旋震荡至分散，再加入乙腈至35 mL，超声提取15 min，放冷至室温，定容。冰浴放置2 h后迅速滤过，进行精密度、回收率实验的上机测试。结果显示：8种抗真菌药物的回收率为89.3%～113.9%，相对标准偏差均不大于8%。

3.5 样品测试

将本方法用于网络平台及实体店购买的10批次样品进行分析测试，阳性样品量值过大时用乙腈稀释至标曲浓度范围内。其中，5批次样品检出抗真菌药物，添加种类及其含量如下表所示。从检测结果可知：“消字号”乳膏中存在添加抗真菌药物的情况，所添加药物以临床常用硝酸咪康唑、酮康唑、盐酸特比萘芬为主，部分产品甚至同时添加3种抗真菌药物。抗真菌药物应在医生、药师等指导下使用，消费者未感染真菌或不恰当使用此类乳膏，会对健康造成损害，应引起监管部门及消费者重视。