蛋白重组类生物制品制剂中吐温80的检测方法研究

郭笑逸 丛天生 赵春雨 杜航 白雪

（长春圣金诺生物制药有限公司 吉林长春 130000）

1 前言

吐温80是药物制剂常用辅料，其化学名为聚氧乙烯20山梨醇酐单油酸酯，为淡黄色至橙黄色粘稠液体。相比其他辅料，其分子结构中碳链结构较长，在水、乙醇、甲醇中易溶，在亲脂性药物中可发挥良好的增溶作用，故在制备难溶性药物制剂时，常将吐温80作为增溶剂、乳化剂及稳定剂[1]。虽然吐温80在制备生物制品制剂时可发挥重要作用，但如果使用过量，则可导致生物制品制剂使用者发生呼吸困难、恶心呕吐、皮疹等不良反应，对使用者的健康造成严重威胁。《中国生物制品规程（2000年版）》中明确规定[2]，无论何种生物制品制剂，其产品中吐温80含量不应高于100μg/mL，因以此作为标准，针对生物制品制剂行吐温80含量检测，加强生物制品制剂质量控制，确保使用者身体健康。本文采用SEC-ELSD对蛋白重组类生物制品制剂中吐温80含量进行检测。

2 材料与方法

2.1 试剂与仪器

试剂：本次研究选用试剂包括吐温80对照品、乙腈、乙酸、超纯水。

仪器：本次研究选用仪器包括高效液相色谱仪（型号Primaide，日本日立公司）；自动微量分析天平（型号BM-20，日本A&D公司）；四元梯度泵（型号1260 Infinity，美国安捷伦公司）；自动进样器（型号AS-2920，郑州克莱科特仪器有限公司）；柱温箱（FCD-230，北京金时速仪器设备有限公司）；蒸发光散射检测器（型号UM5000，深圳市亿鑫仪器设备有限公司）。

2.2 检测方法的建立

2.2.1 确定色谱条件

色谱柱选用TSKgel G2000SWXL（7.8 mm×30 cm，5μm）；

（1）为明确乙腈与乙酸（0.02 mol/L）比例构成流动相对分离效果的影响，对比分析乙腈与乙酸比例分别为3∶7、2∶8及1∶9情况下的分离效果，结果显示当乙腈与乙酸比例为1∶9时，分离效果最好，最终将流动相中乙腈与乙酸比例定为1∶9。

（2）为明确流速对色谱基线平稳性的影响，基于乙腈乙酸1∶9制成流动相，对比观察流速为0.2 mL/min、0.4 mL/min及0.6 mL/min时色谱基线的平稳性，结果显示流速为0.6 mL/min时色谱基线最平稳，最终将流速定为0.6 mL/min。

（3）为明确柱温对出峰时间的影响，对比观察柱温分别为30℃、35℃及40℃情况下的出峰时间，结果显示柱温为35℃时出峰时间最快，最终将柱温定为35℃。

（4）为明确检测波长对色谱基线噪声的影响，对比观察205 nm、225 nm、254 nm及272 nm情况下的色谱基线噪声，结果显示检测波长为225 nm时色谱基线噪声最小，最终将检测波长定为225 nm[3]。

2.2.2 确定蒸发光散射条件

蒸发光散射器漂移管温度设置为110℃；氮气流速设置为2.3 L/min；进样体积设置为10μL。

2.2.3 制备吐温80对照品溶液

利用自动微量分析天平精准称取适量吐温80对照品至烧杯，并向其中加入流动相，制成浓度为5 mg/mL溶液。

2.2.4 制备吐温80储备液

分析天平称取精准称取100 mg吐温80对照品至100 mL规格容量瓶中，加入适量超纯水摇匀，使其充分溶解后，加入超纯水至定容，获取1 mg/mL浓度吐温80储备液。

2.2.5 制备供试品溶液

取重组人干扰素α2b注射液，在规格0.22μm微孔滤膜下过滤，获得续滤液即为供试品溶液。

3 方法学考察

3.1 精密度与重复性实验

移液枪吸取5组同体积吐温80对照品溶液，加超纯水稀释至100μg/mL，连续行5次进样检测，5次检测结果保留时间和峰面积RSD值分别为0.93%和2.69%，表明本次研究选用仪器精密度优异，详见表1。

表1精密度与重复性实验结果（n=5）

3.2 回归方程计算

分析天平精准称取适量吐温80对照品，加入适量超纯水，分别制成浓度为0、10.00、25.00、50.00、75.00和100.00μg/mL吐温80溶液，各浓度各吸取200μL，连续上样6次，并以吐温80溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，详见图1。获得回归方程为：y=1705.9x+238.81，R2=0.9997，可见吐温80浓度在0～100.00μg/mL之间存在良好线性关系。

图1 吐温80标准曲线

3.3 专属性实验

参照注射液制法制成吐温80试样，参照供试品溶液制法制成阴性供试品溶液，进样10μL，色谱图显示，吐温80峰对应保留时间位置未见干扰杂质峰，表明该检测方法具有较好的专属性。

3.4 稳定性实验

精准吸取供试品溶液100.00μL，分别于0、2、4、8、12、24和48h行进样检测，检测结果显示RSD为1.80%，表明供试品溶液稳定性良好，详见表2。

表2 稳定性实验结果（n=7）

3.5 加样回收率实验

精准吸取吐温80储备液10.00、25.00、50.00、75.00和100.00μL至10 mL规格玻璃离心管中，另加入重组人干扰素α2b注射液1.0 mL，进行加样回收率检测。检测结果显示在10.00～100.00μL范围内，加样回收率为99.60%～101.72%，RSD为0.48%，表明该方法准确性良好，详见表3。

表3 回收率实验结果（n=5）

4 样品检测结果

随机抽取5批重组人干扰素α2b注射液，选用SEC-ELSD检测其中吐温80含量，检测结果显示5批重组人干扰素α2b注射液中吐温80含量分别为82.56、79.25、77.95、80.15和75.36μg/mL。

5 讨论

吐温80属于一种不均匀的混合有机物，以往检测生物制品制剂中吐温80含量多采用高效液相色谱仪（HPLC），但由于吐温80无强发色基团，导致其无法实现准确定量，影响检测准确性[4]。相比其他检测方法，ELSD更具独特性，并且其能有效解决HPLC中存在的检测难点，同时ELSD也不会遭受样品光学特性的影响，可实现对任何挥发性不及流动相的样品进行检测[5]。因此本文在将HPLC与ELSD联用，对重组人干扰素α2b注射液中吐温80进行检测。结果表明，SEC-ELSD检测生物制品制剂中吐温80含量准确性、精密度较高，对于加强生物制品制剂安全性管理具有至关重要的作用。