一步法逆转录重组酶聚合酶常温扩增技术（RT-RPA）检测大豆花叶病毒

袁俊杰 魏 霜 龙 阳 马新华 杨卓瑜 卢乃会乾义柯 魏梅生 李桂芬 张永江*

（1.湛江出入境检验检疫局 广东湛江 524000；2.广东出入境检验检疫局；3.伊犁出入境检验检疫局；4.中国检验检疫科学研究院）

1 前言

大豆花叶病毒 （Soybean mosaic virus，SMV）在分类学地位中属马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus），该病毒主要依靠种子和蚜虫传播[1]，在我国大豆品种上的种传率为0%～38%，引起10%～30%的产量下降[2]，如果与菜豆荚斑驳病毒混合侵染大豆，则可造成大豆减产85%[3]，侵染大豆后引起11种大豆植株病状，如花叶、叶片皱缩、顶枯致死、矮化畸荚、种粒斑驳等[4]，严重影响大豆籽粒外观品质和商业价值。

我国不仅是大豆的原产国，也是全球最大的进口国，“十一五”期间，我国大豆进境量由5 000多万吨增长至8 000多万吨，增幅达到60%。近2年大豆进口也一直处于高位增长态势[5]，随着进口大豆数量的急剧增加，植物病毒类有害生物传入我国的风险也日益增高，近年来，上海、江苏、福建、宁波等口岸多次从国外进境的大豆种子中截获到SMV。为防范该病毒随进境大豆种子传播及扩散，迫切需要建立一套准确快速的检测方法应用于进出口快速检疫。

PCR技术由于检测灵敏度高，适用范围广，操作简便等原因应用尤为广泛，但常见的PCR检测技术检测程序复杂、需要精密的仪器、检测时间较长，不利于非实验室环境下现场检测以及基层实验室的推广应用。恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术，由于在恒定温度下即可扩增，因此不需要热循环仪，可用于基层实验室或现场快速检测，例如LAMP曾经用于大豆花叶病毒检测。重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）是近几年出现的一种等温核酸体外扩增技术，目前在医学病原菌、转基因的检测中应用比较广泛[6-10]，植物病毒研究中应用较少，张娜等[11]曾应用于葡萄卷叶伴随病毒的检测，特异性强，灵敏度高。RPA技术主要依赖于3种酶：能结合单链寡核苷酸引物的重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶[12]，不需要模板链的热变性、退火和延伸环节，可以在恒定的低温条件下完成核酸的快速扩增。经探索，发现加逆转录酶于RPA体系中可以将RNA作为模板合成cDNA后再进行扩增，实现一步法扩增，利于RNA病毒核酸检测[13-14]。该技术摆脱了对核酸扩增仪的依赖，增大了核酸扩增的便捷度。

目前国内利用RT-RPA技术检测SMV尚未见报道，本研究根据SMV的外壳蛋白基因序列，设计特异性RPA引物，建立SMV的RT-RPA检测方法，并验证其特异性和灵敏度，旨在建立一种适用于口岸快速检测SMV的简单高效方法。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus，SMV）、菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus，BPMV）、南方菜豆花叶病毒（Southern bean mosaic virus，SBMV）、南芥菜花叶病毒（Arabis mosaic virus，ArMV）及烟草环斑病毒（Tobacco ringspot virus，TRSV） 样品均保存于中国检验检疫科学研究院，同时设置阴性对照（健康大豆种子），样品经PCR检测和序列测定确认后于-80℃冻干保存。植物总RNA提取试剂盒购自天 物科技有限公司；TwistAmp Basic RT为TwistDx Inc公司产品。

2.2 主要仪器与设备

金属浴（Eppendorf ThermoMixer）、电泳仪（600SI，上海博彩生物科技有限公司）、凝胶成像系统（GBOX-F3，GENE 公司）。

2.3 方法

2.3.1 RNA提取

参照试剂盒操作，提取5种病毒样品及阴性对照的总RNA，-80℃保存备用。

2.3.2 引物设计

参考RPA引物设计的要求，根据GenBank数据库中SMV的外壳蛋白基因序列（ID：AH012604.2），设计检测SMV的RPA引物，扩增条带154 bp。上游引物 SMV-F：5′-AAGATGAATCTTCCAATGGTTGA AGGGAAGATC-3′；下游引物 SMV-R：5′-CAAGC TCATATTCATCTTTAACTGCATTGTACC-3′。 引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2.3.3 RT-RPA检测

以2.3.1中制备的RNA为模板，采用SMV-F和SMV-R引物进行RT-RPA扩增，同时设置阴性对照。RT-RPA扩增体系（50 μL）的配制方法如下：向含有冻干酶粉的反应管中加入再水化缓冲液（Rehydration Buffer）29.5 μL，去离子水 12 μL，上、下游引物各 2 μL （终浓度为 0.4 μmol/L）， 模板RNA 2 μL，最后再加入醋酸镁溶液 2.5 μL（280 mmol/L）。将RT-RPA扩增体系充分混匀，置于40℃的金属浴上反应40 min。RPA反应结束后，向RTRPA扩增产物中加入50 μL苯酚/氯仿溶液，充分混匀后12 000 r/min离心2 min，取上清液5 μL于1.5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果。

2.3.4 RT-RPA检测方法特异性评价

按照2.3.3 RT-RPA检测反应体系，对供试样品 SMV、BPMV、SBMV、ArMV 及 TRSV 共 5种病毒的RNA进行检测，设置阴性对照，对所建立的RTRPA检测方法特异性进行评价。

2.3.5 RT-RPA检测方法灵敏度评价

将SMV样品的总RNA进行10倍梯度稀释，共5个稀释度，以梯度稀释的RNA为模板，按照2.3.3所示的反应体系进行RT-RPA灵敏度实验。

3 结果与分析

3.1 RT-RPA检测方法的特异性评价

特异性评价结果显示，SMV样品能够检测到154 bp的特异性条带，其他4种病毒样品BPMV、SBMV、ArMV、TRSV及阴性对照均未检测到条带。同时将阳性扩增产物送公司测序，将测序结果在NCBI上比对，结果显示与大豆花叶病毒序列同源性高达99%。证明该方法具有较强的特异性（图1）。

图1 SMV的RT-RPA特异性检测结果

3.2 RT-RPA检测方法的灵敏度评价

对SMV的RT-RPA检测方法灵敏度检测结果显示（图2），RPA 检测方法反应时间设置在40 min，当稀释度为10-4时，可以检测约154 bp的目的条带，当稀释度为10-5时，未能扩增到目的条带。

图2 SMV的RT-RPA检测灵敏度

4 结论与讨论

大豆花叶病毒是一种在全世界广泛分布并且破坏性极大的植物病毒，可以导致大豆产量骤减以及种质的衰退，每年都会导致许多大豆主产国的巨大经济损失。由SMV引发的大豆花叶病已经在我国大豆产区大量发生，目前对该病毒防治方法主要依赖于化学防治及培育抗性品种，化学防治对环境产生巨大危害，而随着大豆进口量的激增，全球范围内大豆种质出现资源交流，新型病毒株系的出现和致病力强弱的变化也给我国大豆抗 SMV育种工作带来了巨大挑战[15]，因此在口岸检疫部门建立快速、灵敏、简单、高效的SMV检测技术，防范该病毒随进境大豆种子的传入传播，对保护我国大豆生产和种质资源的安全具有重要意义。

相比其他的植物病毒检测方法，本研究建立的RT-RPA方法拥有以下优点：（1）引物设计简单。仅需1对引物即可完成扩增，相比LAMP恒温扩增技术简单，不需要复杂的引物设计过程；（2）常温扩增，不需要昂贵的热循环仪。配备一台小型的水浴锅或者金属浴等温条件下就能实现核酸解链，并且逆转录和RPA恒温扩增反应在同一反应管中连续进行，有效避免了RNA酶对反应体系的污染。适合现场、野外检测。（3）反应时间短。目的DNA片段在短时间内（15～30 min） 即可得到指数级积累。（4）结果易于判断。产物根据引物设计位点有特定大小的条带，相比LAMP产物的弥散带结果更容易判断。RPA技术检测时只需配以琼脂糖凝胶电泳1 h内即可获得准确的结果，操作简单，能够特异性检测到供试带毒样品中的SMV条带，对其他几种植物病毒的检测结果均为阴性，说明该方法特异性高。RPA检测 SMV的灵敏度为10-4稀释度样品提取液，和已报导的普通PCR、组织印迹与RT-PCR[16]、逆转录环介导等温扩增（LAMP）[17]等检测技术的灵敏度相当，说明RPA技术可作为现场快速筛查SMV的有效手段。

当然RPA作为一种新兴的检测技术，应用于SMV的检测还存在一些问题。首先，在引物设计过程中遇到两方面的难点。一是SMV病株分子变异普遍，存在许多株系[18]，在设计SMV特异性扩增引物时应尽可能多的覆盖这些株系，否则容易产生漏检现象。二是为了增强检测方法的特异性，设计引物时不仅仅要考虑到SMV不同株系的种内保守性，还要兼顾其与其他大豆病毒的种间差异性，这就缩小了引物设计的范围。其次，RPA体系对于蛋白活性要求比较高，必须保证体系中任意1种酶均有活性，否则将导致RPA体系停止工作；最后，RPA扩增体系中存在大量蛋白酶，使得RPA扩增产物必须除去蛋白后才能电泳或进行后续试验[19]。

传统的种传大豆病毒检测需要检测种子形成的植株[20-21]，这是因为发病的大豆叶片中含有大量病毒及病毒RNA，而大豆种子较大豆发病叶片病毒含量较少，另一方面，大豆种子中富含多糖及蛋白质等物质，从种子中直接提取，RNA质量和纯度均不高，影响后续检测，因此以往对进境大豆的病毒检测经常需要将疑似带毒种子进行隔离培养直至长出叶片，再对叶片进行检测得到确切结果，检测周期长，耗时耗力。本研究建立的RT-RPA方法可直接对干种子进行检测，且特异性强、灵敏度高，方便快捷，对于进境大豆的检测具有快速的优越性。

5 结语

我国炼油业规模巨大，大豆需求量大，需要长期大量的从国外进口，但是各种植物病害不断出现，严重威胁着我国农林产业的发展。RPA技术操作方便，特异性强、检测灵敏度高，扩增产物检测方便，虽然存在一定的缺点，但随着RPA技术的不断发展、进一步完善以及检测步骤的改良，将有望在大豆花叶病毒的田间诊断、预测预报和大豆脱毒苗的生产等研究领域得到更加广泛的应用，在我国植物病毒快速检测和一线国门检疫提供有效的技术支持。

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