“标本配穴”电针对腹泻型肠易激综合征模型大鼠内脏高敏感性及紧密连接相关因子的影响*

李方文卉，唐宏图，2△

(1.湖北中医药大学，湖北 武汉 430061；2.针灸治未病湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430061)

肠易激综合征(Irritable bowel syndrome，IBS)是常见的功能性胃肠病之一，临床症状表现为腹部不适、腹痛并伴随排便习惯的改变，其中以腹泻型肠易激综合征(Diarrhea predominant irritable bowel syndrome，IBS-D)最为常见[1]。该病在中国的患病率为5%～6%,随着人们日常饮食、生活习惯的改变，肠易激综合征的患病率呈升高趋势[2]。目前IBS-D的治疗主要以传统西医常规治疗为主，如解痉、止泻和抗焦虑抑郁等[3]，其中服用匹维溴铵较为普遍，但疗效较为一般。值得研究的是，中医治疗IBS日益显示出其独特的内涵和优势，蕴藏着较大的潜力，IBS已成为针灸治疗的优势病种，疗效确切[4-5]，而且配穴及组方多样[6]。有研究表明，IBS患者的肠上皮紧密连接结构遭到损坏，会出现腹泻、大便性状的改变[7]。本实验以IBS-D大鼠为研究对象，观察经标本配穴电针干预后对IBS-D大鼠一般体征、内脏高敏感性及肠组织形态学的影响，初步探讨标本配穴电针治疗腹泻型肠易激综合征的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要实验仪器 aquaplus2系列艾科浦超纯水制成机(美国艾科浦国际有限公司)；0.30 mm×13 mm华佗牌毫针；G6805-Ⅱ型电针治疗仪(青岛鑫升实业有限公司)；TGL-10B系列台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.1.2 西药 匹维溴铵片，生产厂家:Abbott Healthcare SAS(法国),批准文号:H20160396,规格:50 mg×15片。

1.1.3 主要试剂 大鼠P物质(SP)检测试剂盒(Bogoo公司)，TNF-αELISA检测试剂盒(德国默沙克)，INF-γ(eBioscience公司)。

1.2 实验动物

本实验采用3月龄SPF级雄性Wistar健康大鼠40只，体质量180～200 g，购买于湖北省医学科学研究院实验动物中心[生产合格证号:SCXK(鄂)2004-0007]，在标准动物房进行1周适应性喂养。饲养于清洁柜，普通饲料喂养，环境温度21～25 ℃，湿度50%～60%。

1.3 实验分组及造模

大鼠适应性喂养7 d后开始进行实验，采用随机数字表法，将40只大鼠随机分为4组：空白组、模型组、标本配穴组和西药组，每组各10只。空白组：常规喂养，不做其他处理；其余各组大鼠以急性应激与慢性应激相结合CAS 方法制备IBS-D大鼠模型，参照文献方法[8]：将大鼠暴露于7种不同的压力源：①禁食24 h;②禁水24 h;③夹尾巴1 min;④45 ℃热水5 min;⑤4 ℃冰水3 min;⑥昼夜倒置12 h;⑦水平振动45 min。所有应激方案每7 d随机应用，持续3周，其中连续2 d无重复特定的压力源。在第28天，1周的休息之后是急性束缚应激，包裹肩部、上肢前肢和胸廓1 h,提高了造模的成功率。造模过程中观察大鼠粪便情况,对比空白组与其他大鼠稀便率评价模型建立效果。即将每组大鼠分开放置于铁笼中, 6 h内分别记录各组大鼠排出的稀便颗数与总的排便颗数，以稀便率(稀便数/总排便粒数×100%)判断IBS-D模型是否复刻成功。

1.4 干预方法

1.4.1 空白组 饲喂普通饲料，每日作抓取训练，共21 d；模型组建立IBS-D模型，每日作抓取、鼠衣穿戴和悬挂训练，共21 d；标本配穴组于造模同时进行干预，参照《实验针灸学》标准穴位图谱[9]取穴，选取实验大鼠的双侧足三里、关元和内关穴，用0.30 mm×13 mm华佗牌毫针直刺，针刺深度3～5 mm，并接G6805-Ⅱ型电针治疗仪，连续波，频率120 r/min，强度1 mA，以大鼠双下肢轻微抖动为宜，留针15 min，1次/d，共21 d。

1.4.2 西药组 造模的同时，予以匹维溴铵混悬液灌胃，每日15 mg/kg，共21 d。

1.5 指标检测

1.5.1 一般体征及粪便含水量的观察 观察每组大鼠的精神状态、体重、毛发色泽、饮食和活动等情况，并在造模前、造模(治疗)4周后2个时间点将大鼠置于代谢鼠笼，在下方垫放洁净滤纸。收集3 h内的大鼠粪便，计数并称湿重，烘干后再次称重，计算粪便含水量=[(湿重-干重)/湿重]×100%。

1.5.2 内脏高敏感性评价 在检测前将大鼠不禁水、禁食12 h,然后将其放在自制的固定器上,采用乙醚浅度麻醉，使大鼠失去抵抗力。先将2 mL注射器与血压计相连，向血压计中注气，分别记下10、20、40、60和80 mmHg所对应的刻度，然后将注射器与8F导尿管相连，由注射器向导尿管中注气，注入至相应的刻度，表示导尿管前端球囊内的压力达到相应的压强。将导尿管自肛门插入，待球囊末端伸入肛门约1 cm,将其固定防止脱出，待大鼠适应后开始实验。向导尿管内注气，使球囊内压强分别为10、20、40、60和80 mmHg。每个压强分别持续20 s，观察大鼠在各个压强下的反应，对其进行半定量评分。每个压力下重复3次并评分，取其平均值并记录[10]。

评分标准参照文献[11]，按照刺激大鼠时的表现评分:0分，无行为反应；1分，仅头部短暂运动，身体不动；2分，腹部肌肉收缩，但未抬离底面；3分，腹肌收缩并抬离底面；4分，骨盆抬起，身体呈弓形。

1.5.3 大鼠血清中TNF-α、INF-γ、SP及D-乳酸检测 内脏高敏感性试验结束后,各组大鼠禁食不禁水24 h,麻醉后,从腹主动脉中采集动脉血5 mL,离心分离血清,4℃保存,ELISA法检测血清中TNF-α、INF-γ、SP和D-乳酸的含量。

1.5.4 采用透射电镜观察大鼠肠黏膜超微结构 分离大鼠肠的组织，用4%多聚甲醛和2%戊二醛将样品进行固定，脱水、包埋、切片和染色，观察肠组织结构的变化。

1.6 统计学处理

使用SPSS 22.0统计软件处理数据,连续型变量采用“均数±标准差”进行统计学描述。若各组数据均呈正态分布且方差齐, 则采用单因素方差分析比较多组均数；若各组数据不全部呈正态分布, 则进行非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 一般体征和粪便含水量的观察比较

空白组大鼠皮毛亮白顺滑，行为活跃，精神佳，进食量正常，大便正常；模型组大鼠皮毛枯燥变黄，精神不振，活动减少，烦躁易怒，饮食减少，大便变软呈稀状，肛周常附着稀便；标本配穴组及西药组在干预后组间无显著差异，精神较模型组更佳，皮毛稍显枯燥且无明显变黄，大便逐步恢复正常。

造模前各组粪便含水量差异无统计学意义(P>0.05)；除空白组外，其他组造模(治疗)后较造模前粪便含水量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与空白组比较，其他组粪便含水量升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，标本配穴组和西药组粪便含水量降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与西药组比较，标本配穴组粪便含水量降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组干预前后粪便含水量的变化

2.2 内脏高敏感性比较

与空白组比较，其他3组大鼠在不同球囊压力下的AWR评分有所升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，标本配穴组及西药组大鼠在不同压力下的AWR评分有降低趋势，各组AWR 评分差异均具有统计学意义(P<0.05)；与西药组比较，标本配穴组在不同压力下的AWR评分显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组干预之后对IBS-D大鼠内脏高敏感性的影响

2.3 大鼠血清中TNF-α、INF-γ、SP和D-乳酸含量比较

与空白组相比，其他3组大鼠血清中TNF-α、INF-γ、SP和D-乳酸含量有所升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，标本配穴组及西药组大鼠血清中TNF-α、INF-γ、SP和D-乳酸含量有降低趋势，差异具有统计学意义(P<0.05)；与西药组比较，标本配穴组大鼠血清中TNF-α、INF-γ、SP和D-乳酸含量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 干预之后对IBS-D大鼠血清中TNF-α、INF-γ、SP和D-乳酸含量的影响

2.4 大鼠肠黏膜超微结构(电镜)

空白组大鼠肠黏膜上皮细胞形态正常，微绒毛排列紧密整齐未见脱落，长度一致，紧密连接结构正常，桥粒清晰可见；模型组大鼠肠黏膜上皮细胞形态损伤，微绒毛部分排列较稀疏，分布不均，紧密连接结构破坏间隙增宽；标本配穴组及西药组大鼠肠黏膜上皮细胞形态较为正常，微绒毛排列较整齐，桥粒清晰可见，其中标本配穴组微绒毛排列较西药组整齐，紧密连接完整，较清晰，肠黏膜屏障损伤减轻。见图1。

图1 大鼠肠黏膜超微结构(电镜,5 000×)

3 讨论

IBS-D是一种临床常见的由多因素共同作用的胃肠疾病，目前尚未有单一机制来阐明该病的发病机制，近年肠黏膜屏障在IBS发病中的作用备受关注[12]，并且肠道通透性增加也是内脏高敏感性发生的关键因素[13]。紧密连接结构(Tight junction，TJ)是肠粘膜屏障的重要构成部分，是最重要的细胞连接，分布于肠黏膜细胞膜的边缘与顶端处，对于细胞通透性和防止有害物质入侵起关键作用，紧密连接结构被破坏则可导致肠道屏障功能受损、增加细胞通透性，使水和电解质的跨膜转运紊乱从而产生腹泻[14-15]。有研究表明，细胞因子如肠上皮屏障中γ干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)是影响紧密连接的重要因子，当其表达上调时可损坏肠黏膜屏障,致使渗透性异常[16]。其中TNF-α对肠上皮屏障的跨上皮电阻具有降低作用，INF-γ能下调紧密连接蛋白occludin、ZO-1的高表达，使肠上皮细胞膜的通透性增强，还可造成肠道感觉和动力异常[17]。P物质(Substance p,SP)是一种感觉性的、可促炎性的神经递质，SP表达增加会促使Th1细胞释放IFN-γ与TNF-α，导致肠道粘膜遭到破坏，同时炎症反应会增加胃肠道的负担，干扰胃肠道反射，应激诱导内脏感觉系统敏锐化[18]。D-乳酸水平可以有效评价肠粘膜的通透性与肠道损伤情况，反应肠道机械屏障的功能[19]。有研究表明，下调血浆中D-乳酸水平可以有效改善肠上皮紧密连接状态，缓解肠易激综合征症状[20]。

肠易激综合征在中医学中属“泄泻”“腹痛”的范畴，在《中国临床诊疗术语》中明确IBS病名为“肠郁”，该病发病多以情志失调为诱因，导致气机紊乱，肠腑传导失司。治疗以调神理气、通导肠腑为治则，以调心神为基础，达到标本兼治的效果[21-22]。《素问·刺热论》中记载：“病虽未发，见赤色者刺之，名曰治未病。”针灸用于预防疾病称为“逆针灸”,“逆针灸”一词首见于明代高武《针灸聚英》曰:“无病而先针灸曰逆。逆，未至而迎之也”[23]。是中国传统中医药治未病的主要手段之一，本实验在造模同时开始予以针刺治疗蕴含着针灸“治未病”的思想理论。在“治未病”的指导思想下，采用标本配穴法。关元穴与足三里穴为临床常用的强壮保健要穴，关元穴为任脉腧穴，是小肠之募穴和足三阴与任脉的交会穴，是先天之根本，真元之根，为三焦之气所生处，一身元气之所在，可补充元气，增益精元，固护人体先天之本。足三里是足阳明胃经的合穴、胃之下合穴，具有和胃健脾、补中益气、通调腑气和扶正以固护后天之本的功能。两穴配伍共奏固护元气、强身健体之功效。内关穴为八脉交会穴，与阴维脉相通，通过胃经、脾经和肾经，阴维脉与冲脉在胃、心、胸部相合，调节情志失和、气机阻滞相关病证，具有宣通三焦的功效，研究表明，针刺内关穴可改善腹痛、腹泻，减弱内脏高敏反应等整体症状[24-25]。三穴合用，共奏调理心神、通导肠腑以达从心论治和标本兼顾的功效。

本实验结果表明：IBS大鼠为腹泻型，模型复刻成功。与空白组比较，模型组大鼠的肠上皮细胞紧密连接结构遭到破坏，AWR评分、TNF-α、IFN-γ、SP和D-乳酸水平升高。经过治疗后，标本配穴组与西药组AWR评分和血清中TNF-α、IFN-γ、SP及D-乳酸含量下降，电镜下肠粘膜上皮细胞形态较为正常，微绒毛排列较整齐，桥粒清晰，黏膜损伤、紧密连接结构得到改善，且标本配穴组比西药组更接近于空白组水平。研究说明，标本配穴电针可改善细胞因子水平，保护肠道通透性，降低内脏高敏感性，为临床上治疗腹泻型肠易激综合征提供新的配穴思路。