NLRP3信号通路相关因子参与夹脊电针改善脊髓损伤大鼠的作用机制研究*

刘玲玲，梅继林，李 诺，李晓宁

(1.青岛市妇女儿童医院，山东 青岛 266011; 2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;3.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)是脊髓最严重的并发症之一，常因神经元的不可逆丢失而导致严重的神经功能障碍[1]。急性脊髓损伤病理复杂，可分为原发性损伤和继发性损伤，损伤脊髓组织的修复是临床的一大挑战[2-3]。从时间进程上，SCI分为两个阶段。原发性损伤是对脊髓的初始机械损伤，继发性损伤是由局部微环境改变引起的脱细胞化和神经元坏死，随后损伤部位明显扩大至脊髓的更多节段[4]。越来越多的研究表明，神经炎症是导致SCI后继发性损伤的关键因素，而炎症小体的激活又反过来引发了神经炎症[5-6]。炎性小体是一种多聚体蛋白复合物，由caspase-1、caspase活化募集域蛋白(ASC)和传感器NLR蛋白(如NLRP1、NLRP2和NLRP3等)组成[7]。小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)的巨噬细胞，因此是减少SCI后神经炎症的有前景的治疗靶点[8]。大鼠SCI模型中，已经发现NLRP3在小胶质细胞中表达[9]，本课题组前期试验也已经验证了NLRP3在SCI模型中的高表达[10]，NLRP3信号通路相关因子是否参与夹脊电针改善脊髓损伤大鼠的作用过程还有待验证。

1 实验材料

1.1 实验动物及分组

Sprague-Dawley(SD)大鼠120只，购自辽宁长生生物技术有限公司。分为假手术组(Sham组)、模型组(Model组)、夹脊电针组(EA组)、P2X7干扰组(P2X7R siRNA)和干扰对照组(Control siRNA)共5组,各24只;每组又分1 d、3 d、7 d和21 d共4个时间点，实验过程符合国际动物使用关怀标准。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 仪器 石蜡切片机(德国Leica)；电热恒温培养箱(天津泰斯特公司，DH36001B)；电热恒温鼓风干燥箱 (上海精宏实验设备)；超纯水系统(香港Heal Force)；激光共聚焦扫描显微镜(日本OLUMPUS)；电针仪(中国英迪KWD-808II)。

1.2.2 试剂 苏木精(中国Solarbio);过氧化氢(中国国药);DAB显色液(中国Solarbio);山羊血清(中国Solarbio);cleaved caspase-1(中国Wanleibio);P2RX7(以色列alomone);IL-18(中国Bioss);HRP标记山羊抗兔IgG(美国thermofisher);OX42(美国abcam);FITC标记山羊抗小鼠IgG(中国Beyotime);Cy3标记山羊抗兔IgG(中国Beyotime);抗荧光衰减封片剂(中国Solarbio);P2X7慢病毒和阴性对照慢病毒(沈阳万类生物科技有限公司)。

2 实验方法

2.1 模型制备及评价

采用改良Allen’s打击法制成脊髓损伤动物模型，予10%水合氯醛腹腔麻醉，大鼠麻醉之后将大鼠固定于手术台上，以胸10为中心脱毛、备皮和消毒，以胸10棘突为中心切开3 cm手术切口，暴露胸9～11棘突。采用改良Allen’s打击法，使脊髓组织出现急性损伤，随后大鼠出现尾巴摆动，身体痉挛性抽搐，预示造模成功，再缝合伤口。术后给予生理盐水，给予青霉素注射。大鼠苏醒后通过BBB评分1～3分及下腹部触诊膀胱胀大确认造模成功[11]，使用BBB评分对大鼠后肢功能评分，1～3分纳入本实验。

2.2 干预方法

2.2.1 假手术组(Sham) 切除相应椎板，仅仅暴露脊髓，但不打击脊髓，同其它各组大鼠一同捆绑，常规饲养，不给予任何处置。

2.2.2 模型组(Model) 造模制备成功后，除正常捆绑外，不给予任何处理。

2.2.3 夹脊电针组(EA) 模型制备成功后3 h给予夹脊电针治疗：华佗牌针灸针，直刺入胸9、胸11节段两侧夹脊穴下4～5 mm，并连接电针仪，将电针仪正负极接头分别夹在同侧夹脊穴两针柄，定时30 min，电流输出在1～2 mA，输出频率为100 Hz，每天治疗1 次，每次30 min[12]。

2.2.4 P2X7干扰组(P2X7R siRNA) 脊髓损伤模型制作成功后，注射8 μL 滴度为107 TU/mL的P2X7R干扰慢病毒悬液，选取损伤部位头端和尾端进行注射，各注射点注射2 μL病毒悬液。

2.2.5 干扰对照组(Control siRNA) 同P2X7干扰组注射阴性的对照慢病毒无其他处置。

2.3 指标检测

2.3.1 BBB评定各组大鼠肢体运动功能 各组大鼠在造模成功后第1、3、7和21天运用BBB评分量表评定，评分最高21分，评分最低0分[13-14]，评分越低表示大鼠后肢运动障碍越严重。

2.3.2 免疫组化法检测各组大鼠脊髓组织中NLRP3、ASC及IL-18的表达情况 固定后的脊髓组织修复，酒精脱水，二甲苯固定，包埋后切成层厚为5 μm的薄片，60℃温箱中2 h，烘干，脱蜡，随后进行IHC检测。

2.3.3 免疫荧光双标法检测观察NLRP3与OX42共定位 切片脱蜡至水：将每张石蜡切片置于切片架上，于60℃烘箱中烤片，分别浸于I级和II级二甲苯中，再依次浸入95%、85%和75%乙醇；抗原修复：置于煮沸抗原修复液中，低火修复；血清封闭：滴加山羊血清至完全覆盖组织；一抗孵育：滴加一抗共同孵育；二抗孵育：滴加荧光二抗完全覆盖组织；DAPI复染：滴加DAPI以复染核；抗荧光衰减封片：胶头滴管滴加抗荧光衰减封片剂，封片；镜检[15]。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 BBB评分法观察各组大鼠运动功能

与Sham组比较，各时间点Model组大鼠BBB评分显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与P2X7R siRNA组比较，3 d、7 d和21 d各时间点Control siRNA组大鼠BBB评分显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与Model组比较，术后3 d、7 d和21 d共3个时间点EA组和P2X7R siRNA组大鼠BBB评分均升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。随着时间的推移，EA组和P2X7R siRNA组大鼠BBB评分表现为上升趋势，表明EA组和P2X7R siRNA组都可以改善大鼠脊髓损伤后肢体功能，治疗21 d时间点效果更显著。见表1。

表1 各组大鼠治疗前后BBB评分的变化

3.2 免疫组化法检测各组大鼠脊髓组织相关因子表达变化情况

3.2.1 各组大鼠脊髓组织NLRP3表达变化比较 Sham 组大鼠脊髓组织中NLRP3表达量极低，与Sham组比较，各时间点Model组大鼠脊髓组织NLRP3蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，表明模型制备成功。与P2X7R siRNA组比较，3 d、7 d和21 d各时间点Control siRNA组大鼠脊髓组织NLRP3蛋白表达水平仍较高，差异有统计学意义(P<0.05)，表明构建干扰慢病毒载体成功。经夹脊电针治疗后，3 d、7 d和21 d EA组大鼠脊髓组织NLRP3蛋白表达均低于Model组，差异有统计学意义(P<0.05)，质粒病毒装载小片段RNA注射脊髓组织后，3 d、7 d和21 dP2X7R siRNA组大鼠脊髓组织NLRP3蛋白表达均低于Model组，差异有统计学意义(P<0.05)；见图1、表2。随着时间的推移，Model组与EA组大鼠脊髓组织NLRP3蛋白表达在1 d、3 d和7 d表现为上升趋势，7 d时表达量达到最高，21 d时出现下降趋势，且EA组各时间点表达量始终低于Model组。结果表明脊髓损伤后微环境中NLRP3蛋白表达明显升高，质粒病毒siRNA干扰P2X7R能抑制NLRP3蛋白表达，夹脊电针也可抑制NLRP3蛋白的表达，进而可能抑制其介导的炎症反应，治疗脊髓炎性损伤，随着时间增加，治疗优势更明显。

图1 各组大鼠脊髓组织NLRP3表达的比较(400×)

表2 各组大鼠脊髓组织NLRP3的平均光密度值

3.2.2 各组大鼠脊髓组织ASC表达比较 Sham组大鼠脊髓组织中ASC蛋白表达量极低，与Sham组比较，各时间点Model组大鼠脊髓组织ASC蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，表明模型制备成功。与P2X7R siRNA组比较，3 d、7 d和21 d各时间点Control siRNA组大鼠脊髓组织ASC蛋白表达水平仍较高，差异有统计学意义(P<0.05)，表明构建干扰慢病毒载体成功。经夹脊电针治疗后，3 d、7 d和21 d EA组大鼠脊髓组织ASC蛋白表达均低于Model组，差异有统计学意义(P<0.05)；质粒病毒装载siRNA干扰P2X7R表达后，3 d、7 d和21 d各时间点P2X7RsiRNA组大鼠脊髓组织ASC蛋白表达水平均低于Model组，差异有统计学意义(P<0.05)；见图2、表3。随着时间的推移，Model组与EA组大鼠脊髓组织ASC蛋白表达在1 d、3 d表现为上升趋势，7 d、21 d时出现逐渐下降趋势，且EA组各时间点表达量始终低于Model组,结果表明脊髓损伤后微环境中ASC表达蛋白显著升高，夹脊电针和质粒病毒siRNA干扰P2X7R能抑制ASC蛋白的表达，可能抑制NLRP3介导的炎症反应，减轻脊髓损伤炎性损伤。

表3 各组大鼠脊髓组织ASC的平均光密度值

图2 各组大鼠脊髓组织ASC表达的比较(400×)

3.2.3 各组大鼠脊髓组织IL-18表达比较 Sham组大鼠脊髓组织中IL-18表达量极低，与Sham组比较，各时间点Model组大鼠脊髓组织IL-18表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，表明模型制备成功；与P2X7R siRNA组比较，3 d、7 d和21 d各时间点Control siRNA组大鼠脊髓组织IL-18表达水平仍较高，差异有统计学意义(P<0.05)，表明构建干扰慢病毒载体成功。经夹脊电针治疗后，7 d、21 d EA组大鼠脊髓组织IL-18表达均低于Model组，差异有统计学意义(P<0.05)，质粒病毒装载siRNA干扰P2X7R表达后，3 d、7 d和21 d各时间点P2X7R siRNA组大鼠脊髓组织IL-18表达水平均低于Model组，差异有统计学意义(P<0.05)；见图3、表4。随着时间的推移，Model组大鼠脊髓组织IL-18表达1 d、3 d逐渐升高，维持到7 d达到最高值，21 d出现缓慢下降的趋势；EA组大鼠脊髓组织IL-18表达在1 d到3 d出现上升的趋势，3 d达到最高值后7 d、21 d出现了显著的表达下降趋势。结果表明脊髓损伤后脊髓组织微环境中促炎因子IL-18的表达水平显著升高，质粒病毒siRNA干扰P2X7R能抑制促炎因子IL-18的分泌，夹脊电针也能抑制促炎因子IL-18的分泌，进而治疗脊髓组织炎性损伤，随着时间的增加，治疗优势更加显著。

表4 各组大鼠脊髓组织IL-18的平均光密度值

图3 各组大鼠脊髓组织IL-18表达的比较(400×)

3.3 各组大鼠脊髓组织中NLRP3与OX42共定位表达

NLRP3与小胶质细胞的标志物OX42免疫荧光双染可见，NLRP3与OX42存在共定位，且红色荧光为NLRP3阳性，绿色荧光为OX42阳性，蓝色荧光为细胞核，双阳性为橙色，与Sham组比较，各时间点Model组NLRP3与OX42共定位阳性表达明显增多，夹脊电针治疗后3 d、7 d和21 d EA组NLRP3与OX42共定位阳性表达明显低于Model组，质粒病毒装载siRNA干扰P2X7R表达后，3 d、7 d和21 d P2X7R siRNA组NLRP3与OX42共定位阳性表达明显低于Model组，在4个时间点中，1 d、3 d和7 d时间点Model组和EA组NLRP3与OX42共定位阳性表达呈现上升趋势，7 d时阳性表达最多，21 d阳性表达有下降趋势。以上实验结果表明脊髓损伤后NLRP3在脊髓组织小胶质细胞中表达明显增多，夹脊电针和质粒病毒装载siRNA干扰P2X7R表达能够有效地抑制小胶质细胞中的NLRP3表达起到抑制炎症反应的作用。见图4。

图4 各组大鼠脊髓组织中P2X7R与OX42共定位表达(600×)

4 讨论

SCI遵循双阶段时间进程，初级损伤是由过度的机械撞击直接导致的，导致椎体骨折，引起急性出血、坏死细胞死亡和神经元丢失。继发性损伤会导致弥漫性的、持久的损伤，这对胶质细胞和神经细胞具有破坏性，并引发延迟性细胞死亡和进行性神经变性，随后损伤部位显著扩大到脊髓的更高节段[16-18]。炎症是来自中枢神经系统先天免疫系统的一种反应，在组织损伤后中枢神经系统的病理中发挥重要作用,在SCI的继发期发挥关键作用[19-20]。课题组前期已经发现脊髓损伤后NLRP3炎症小体可以被激活并且引起一系列的炎症级联反应，夹脊电针可以减轻NLRP3炎症级联反应，促进脊髓损伤后的肢体功能恢复，由于P2X7R是NLRP3炎性小体最有效的激活因子之一[21]，据此引入P2X7R抑制剂，增加P2X7R抑制剂组和对照观察组，延伸观察时间点，进一步探讨在SCI大鼠中夹脊电针对NLRP3信号通路的作用机制。

炎症反应的启动与“炎性小体”的多蛋白复合体的形成密切相关，炎症小体是一种胞质化的多蛋白复合物，作为细胞内细胞稳态破坏的传感器，它们的刺激导致促炎细胞因子pro-IL-1b和pro-IL-18通过活化的caspase-1蛋白水解裂解。NLRP3炎性小体活性复合物由一个中心支架蛋白NLRP3结构域、一个凋亡相关斑点样蛋白(包含caspase活化和招募结构域CARD)ASC和caspase-1酶的前体形式pro-caspase-1组成。一般而言，每个炎性小体的3个主要区域是1个胞质传感器、1个接头蛋白和1个效应体半胱天冬酶。对NLRP3而言，细胞内传感器为NLRP3，接头蛋白为ASC，Caspase-1是效应体[22-23]。炎性小体的形成激活caspase-1，进而将pro-IL-1β和pro-IL-18裂解成成熟的IL-1β和IL-18[12]，炎性因子的成熟和分泌进而引起一些列的炎性反应。小胶质细胞活化介导的炎症反应在中枢神经损伤机制中发挥重要作用，脊髓损伤后，脊髓组织中的小胶质细胞被大量激活，损伤后引起炎症反应进一步加重脊髓组织的继发性损伤。因此调控小胶质细胞活化引起的炎症反应成为了治疗脊髓损伤的重要切入点，小胶质细胞活化介导的炎症信号通路存在多条，其中离子门控制通道受体P2X7R是小胶质细胞介导炎症表达极其重要信号通路。P2X7R是作为一种ATP门控型离子通道，脊髓损伤后细胞外ATP与P2X7R结合引发的寡聚化反应，使离子通道迅速开放，产生K+外流，引起胞内K+的迅速耗竭，进而激活NLRP3炎症小体。有学者通过共聚焦显微镜和免疫共沉淀观察P2X7R和NLRP3在小鼠小胶质细胞和小鼠腹膜巨噬细胞表达和定位情况[24]。发现P2X7R通道或孔洞打开导致细胞内离子微环境的局部修饰，从而驱动NLRP3炎性小体成分的募集，并促进其在P2X7R附近的自身组装。同时有研究观察到细胞内K+浓度降低，质膜通道(包括P2X7R)开放会激活NLRP3炎症小体的活化，由此可见P2X7R离子门通道的打开是NLRP3活化的重要步骤。Gustin等研究结果表明，小鼠大脑中形成有功能的NLRP3炎性小体的能力仅限于小胶质细胞，而不是的星形胶质细胞[25]。同样，在大鼠SCI模型中，NLRP3也被证实在小胶质细胞中表达[20]。

本研究发现，脊髓损伤后，模型组NLRP3、ASC及IL-18蛋白表达量增加，说明此信号通路的相关因子参与了脊髓损伤的机制，抑制剂组NLRP3、ASC和IL-18表达量均显著降低，是由于特异性地抑制P2X7R的表达，从而减少微环境中NLRP3、ASC及IL-18的含量，抑制脊髓组织的炎症反应，发挥神经保护作用。

由此可知夹脊电针能有效抑制NLRP3蛋白及基因的表达，进而可能减轻脊髓损伤的炎性损伤，这与课题组前期研究发现夹脊电针干预能抑制脊髓损伤组织NLRP3炎症小体活化，进而抑制炎症反应结果相一致[10]，并且免疫荧光双染结果也表明NLRP3在小胶质细胞中表达，这与前人的研究结果一致[20]。

脊髓损伤后经脉阻滞，气血亏虚，肌肉痿废不用，与“痿证”相契合，多归属于此。“痿”谓虚弱，无力以运动。《血证论》曰：“痿者，足废不能行之谓”；《冯氏锦囊秘录》云：“痿者，手足痿软无力，百节缓纵不收也”。脊髓损伤无外内外因，外因主要由外伤所致，脊髓的位置及其生理、病理都与督脉密不可分。

夹脊穴最早的描述出现在《素问·刺疟》曰:“十二疟者,……又刺项以下侠脊者必已。”《痧胀玉衡》记载：“盛经出血，又刺项以下挟脊者，必已”。《肘后备急方》曰：“令正当心厌，又夹脊左右一寸，各七壮”“去脊各一寸，灸之百壮”。针灸学家承淡安先生在著作《中国针灸学》将夹脊穴命名为“华佗夹脊穴”，并且精确了华佗夹脊穴的定位。穴位均位于脊柱两侧，左右对称，夹脊穴从上到下形成与督脉平行的夹脊穴带，位于足太阳膀胱经和督脉的中间，承载着成为沟通两条阳经的纽带，发挥着调理脏腑阴阳、疏通经络气血的关键作用[26]。从穴位解剖位置角度而言，每个夹脊穴处从浅到深涉及到皮肤、血管及局部肌肉外，还会有相应的脊神经和交感神经伴行，针刺可以促进血液流动、缓解肌肉酸痛的作用，启动神经体液调节机制，分泌神经末梢化学因子，改善相应脏腑功能[27]。电针形成的电磁场又会强化夹脊针的作用，使其作用效果发挥到更大。

电针是一种在针灸针针柄位置连接电针治疗仪的治疗方法，将电刺激与传统针刺相结合，增加了刺激强度。研究表明，电针治疗SCI可能是增加神经营养因子表达含量、增加内源性神经干细胞表达量、增加了患者脊髓的血流量、抑制碱性成纤维细胞生长因子在体内合成、阻断逆行性中枢神经元损伤途径、抑制脊髓损伤后Ca2+含量等[28]。夹脊电针将穴位治疗及电针的双重优势充分利用，对损伤部位活血化瘀，并且催发经气传导，气血流通，达到镇痛，疏通督脉、膀胱经气和调理脏腑气血的作用。

本实验结果显示：脊髓组织损伤的大鼠脊髓组织中的炎症相关因子表达量增加，而夹脊电针可以降低炎症因子的表达量，从而加快了脊髓损伤大鼠运动功能恢复。因此，夹脊电针改善脊髓损伤大鼠的运动功能，可能与抑制NLRP3信号通路相关炎症因子表达有关。