悬灸与直接灸治疗类风湿关节炎小鼠的对比研究*

李尊元，李晓燕，赵 创，陈春兰，李 淼，谭 倩，梁 薇，刘志丹△

(1.上海市宝山区中西医结合医院，上海 201999；2.上海中医药大学附属曙光医院宝山分院，上海 201999；3.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437；4.南京中医药大学，江苏 南京 210046)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以侵蚀性关节炎为主要表现的自身免疫性疾病，临床表现为对称性、持续性多关节炎，最终导致关节畸形和功能丧失，严重影响患者生活质量[1]。目前现代医学常用的RA治疗药物有抗风湿药(DMARDs)、非甾体类抗炎药(NSAIDs)、糖皮质激素、生物制剂以及靶向小分子药物等[2]。RA发病机制尚不明确，已发现炎症因子及自身免疫反应介导的免疫系统紊乱在RA的发病中起重要作用。

类风湿关节炎在中医学中属“痹症”。《素问·生气通天论》云：“阳气者，精则养神，柔则养筋。”《千金方》中记载：“历节风痛，但痛处灸二七壮，佳。”从古至今的文献均记载，艾灸能治疗包括类风湿关节炎在内的痹病。现代研究显示，艾灸能够减轻RA患者临床症状、改善生活质量[3-6]，作为RA综合治疗方案的完善和补充，有着重要的意义。临床上悬灸与直接灸是灸法实施的两种不同方式，其治疗RA的临床疗效均有文献支持[7-10]。但运用动物模型研究艾灸疗法治病机制的时候，有些研究运用直接灸(麦粒灸)[11-14]，有些运用悬灸[15-21]；那么究竟两种艾灸方法在疗效和机制上有何不同，是值得探讨的重要问题。

本研究在CIA小鼠模型基础上，比较了两种不同灸法对于CIA小鼠关节炎的干预效果，报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物、饲养场所、医学伦理

8～10周龄雄性DBA/1J小鼠36只，提供单位为南京生物医药研究院实验动物中心，其许可证号：SCXK(苏)2015-0001。先将小鼠适应性饲养1周，第1周后将其随机分组，每组各6只，共计6组。将其中1组设为正常组，另外5组小鼠先混合，之后进行造模，待模型成功后，将其随机分为模型组、安慰治疗组、不治疗组、悬灸组和直接灸组。小鼠分笼饲养，每笼各3只，采用自然光照，投放普通小鼠饲料，并定期清洁、消毒。本实验研究中对动物的处置均按照国家科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》执行。本研究动物实验经过宝山区中西医结合医院伦理委员会审核并取得伦理批件(201412-11)。

1.2 材料和试剂

本实验采用的甲醛、无水乙醇、石蜡、氨水和二甲苯由上海国药集团提供；牛Ⅱ型胶原由Chondrex公司提供；福氏完全佐剂(Freunds' Complete adjuvant,FCA)、福氏不完全佐剂(Incomplete Freund's Adjuvant,IFA)由Sigma公司提供；苏木素、伊红由BASO公司提供；中性树脂由上海长岛生物技术有限公司提供；小鼠IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17及TGF-β酶联免疫分析(ELISA)试剂盒由Bio-swamp公司提供；淋巴细胞分离液由CEDARLANE公司提供；蛋白定量BCA试剂盒由南京建成公司提供；小鼠Anti-CD4 FITC、小鼠Anti-CD25 APC、鼠Anti-IL-17 PE、鼠Anti-FoxP3 PE由Ebioscienc公司提供;冰乙酸由上海试剂四厂提供。实验中所有化学试剂均为分析纯。

1.3 实验仪器

石蜡切片机：徕克公司，SQ2125；摊片机：徕克公司，PPTHK-21B；酶标仪：芬兰雷勃，MK3；CX41正置显微镜：OLYMPUS公司；酶联免疫检测仪：Bio- Rad公司，model 550； CO2恒温培养箱：Thermo Forma公司，3111；低温冷冻离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司，TG-16M；流式细胞仪：Bio- Rad公司，Accuri C6；数码相机：NIKON公司；IMS图象分析系统：基尔顿生物科技(上海)有限公司，D5100。

1.4 模型的建立

参照文献[22]建立Ⅱ型胶原诱导的类风湿关节炎小鼠模型：Ⅱ型胶原(牛)溶解在浓度为0.05 mol/L的醋酸中，将其配制成2 mg/mL的胶原溶液，4℃过夜。用样本均质仪进行低速混合时，滴加等体积的FCA，配制终浓度为1 mg/mL的Ⅱ型胶原乳剂。以每只小鼠200 μL的剂量于尾根部皮下注射进行免疫。21天后再次在鼠尾基部皮内注射100 μLⅡ型胶原乳剂进行二次免疫。以小鼠出现至少1只腿踝关节明显红肿为模型成功建立。

1.5 艾灸治疗

参照文献[23-26]中大鼠的取穴定位[肾俞：第2腰椎棘突下两旁；足三里(后三里)穴：膝关节后外侧，腓骨小头下方]进行取穴，取穴后用记号笔在穴位处标记。将小鼠放入特制的艾灸装置中，露出需要艾灸的穴位进行艾灸。选用45∶1精制艾绒作为艾灸材料，生产厂家:南阳艾颜堂艾绒有限责任公司。将精制艾绒制成1 mg/壮大小进行艾灸：悬灸组用镊子将艾绒夹持并点燃，置于略高于动物穴位毛发处(避免烧伤皮肤)；直接灸组直接置于穴位毛发上(可能会造成一定程度的皮肤烧伤)。安慰治疗组用医用棉花制成上述艾绒同等大小，用上述方法进行艾灸。每只小鼠每穴艾灸6壮。连续治疗6天为1个疗程，共治疗2个疗程，两个疗程间休息2天。

1.6 关节肿胀度观察

从艾灸治疗第1天开始，每隔1天对发病的关节进行关节炎指数评分，一共观察8次。评分标准参照文献[27-28],0分:无红斑、水肿；1分:两只足小趾关节红斑水肿；2分:全部趾关节或前脚掌红斑水肿；3分：踝关节以下延伸到趾红斑水肿；4分：踝关节至全爪红肿或畸形。本评分标准最高分16分，关节炎指数为每只小鼠四肢评分的总和。根据观察各次关节炎指数评分结果，绘制出曲线图。

1.7 取材及病理观察

模型组的设立，是为说明CIA模型治疗前的情况，该组小鼠造模成功后即予以处死并取材；不治疗组不进行治疗，目的为说明CIA小鼠未经治疗的15天后的情况，仅实施与艾灸组相同的抓取过程，将结果与艾灸组进行对比，成模15天后与悬灸组、直接灸组和安慰治疗组一同处死、取材。

于艾灸组末次治疗24 h后，用颈椎脱臼法处死各组小鼠，并于75%的酒精中浸泡10～15 min，然后取及和踝关节。脾脏经剪碎、研磨，过200目细筛，用淋巴细胞分离液重悬、离心后吸取中间白膜层。该层即为脾单核细胞。加RMPI-1640培养基洗涤1次，加红裂液，离心，再洗涤1次；洗涤结束后，细胞重悬，计数、定量、分管冻存。踝关节用10%福尔马林固定，石蜡包埋，矢状面切片，常规HE染色。

1.8 ELISA

方法参照所购小鼠IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17及TGF-β酶联免疫分析(ELISA)试剂盒以及BCA蛋白定量试剂盒说明书。用酶标仪测定OD值(450 nm波长)。划定标准曲线，计算上述指标的含量，统计分析。

1.9 流式细胞分析

Th17细胞检测：调整细胞浓度(1×106个/mL)，接种24孔板，加佛10 ng/mL波醇乙酯(PMA)，1 μmol/L离子霉素和500 ng/mL蛋白质转运抑制剂莫能菌素，37℃、5%CO2培养4 h；收集细胞、重悬；加anti-CD45 μL，4℃避光孵育1 h。设不加抗体作管为阴性对照。孵育结束，离心、沉淀、PBS洗、重悬、离心，弃上清；所有样本离心、弃上清、洗两次，细胞沉淀PBS重悬，加入IL-17抗体1 μL，4℃避光孵育1 h。孵育结束后，用预冷的PBS洗涤两次，上机检测。

Treg细胞检测步骤：调整细胞浓度(1×106个/mL)。每样本设检测管14个：阴性对照管：不加抗体，只加100 μL细胞悬液；同型对照管：加入细胞悬液100 μL和同型对照抗体5 μL；CD4单标管：加入细胞悬液100 μL和anti-CD4 5 μL；CD25单标管：加入细胞悬液100 μL和5 μL anti-CD25； Foxp3单标管：只加细胞悬液100 μL；CD4+CD25+FOXP3三标管：先加入100 μL细胞悬液，anti-CD4 5 μL，anti-CD25 5 μL，轻轻混匀；4℃避光孵育1～2 h。孵育1～2 h后，Foxp3单标管和CD4+CD25+FOXP3三标管进行离心、弃上清，细胞沉淀洗两次，0.5 mL 1× Foxp3 FIX buffer重悬，4℃固定30 min；其他检测管可进行上机检测；固定结束后，Foxp3单标管和CD4+CD25+FOXP3三标管每管分别用0.5 mL 1× Foxp3 Permeabilization and Wash buffer洗涤两次；洗涤结束后，Foxp3单标管和CD4+CD25+FOXP3三标管每管分别加入0.5 mL 1× Foxp3 Permeabilization和Wash buffer，放置4℃破膜30 min；然后，Foxp3单标管和CD4+CD25+FOXP3三标管每管分别加入Foxp3抗体5 μL；4℃避光孵育1 h。上机检测步骤同Th17检测。

1.10 统计学方法

所有数据都以均数±标准差表示。计量资料数据若符合正态分布同时满足方差齐性要求的，采用方差分析进行组间比较；不符合正态分布或方差不齐的数据，则用非参数检验(秩和检验)进行分析。P≤0.05则认为有统计学意义。用SPSS13.0统计软件进行分析计算。

2 结果

2.1 关节形态变化

如图1所示：CIA模型建立后，模型组与正常组关节比较明显红肿。经治疗，悬灸组小鼠关节红肿相对模型组有较明显的消退；而安慰治疗组和不治疗组小鼠关节红肿无明显消退，直接灸组小鼠肿胀较前更加明显。不治疗组、悬灸组、直接灸组和安慰治疗组4组小鼠关节评分组间差异经重复测量数据的方差分析比较，从第4次开始差异有统计学意义(P=0.03)。根据图2曲线变化及统计分析，可判断第4～8次评分悬灸组小鼠关节评分均低于其它3组(P<0.05)。这表明悬灸对治疗小鼠的关节肿胀有一定作用。

图1 RA小鼠艾灸治疗前后的关节肿胀变化及与正常爪的对比

图2 艾灸组与对照组RA小鼠的关节评分曲线对比

2.2 关节病理分析

如封三彩图3所示类风湿关节炎模型建立后(即模型组)，与正常组对比，关节面较正常组粗糙，且滑膜层变薄，经过悬灸治疗后，小鼠病变关节面恢复平整，滑膜层变厚，与正常组较为接近。而直接灸组，治疗后粗糙的关节面有一定程度的恢复，但不如悬灸组恢复得好。而安慰治疗组与模型组、不治疗组比较变化不明显(图中方框所示为关节滑膜面)。

2.3 ELISA检测脾细胞相关细胞因子表达

统计分析显示：CIA模型小鼠脾脏中IL-1β、IL-6、IL-17等致炎因子表达增高(P=0.00)；悬灸和直接灸治疗后上述致炎因子含量相应降低(与模型组比较P=0.00)，且两组之间无统计学差异(P>0.05)；安慰治疗组、不治疗组与模型组无显著的统计学差异(均P>0.05)。而抑炎因子IL-10、TGF-β在CIA模型小鼠脾脏中表达降低；悬灸和直接灸治疗后它们的表达明显提高(与模型组比较P=0.00)，且两组之间无统计学差异(P>0.05)；安慰治疗组、不治疗组与模型组无显著的统计学差异(均P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠炎症相关细胞因子表达比较单位:pg/mL)

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05

2.4 流式细胞术分析脾脏Th17、Treg细胞数量

统计分析显示：与正常小鼠比较，CIA模型小鼠Treg细胞下降(P=0.00)；悬灸治疗后，Treg细胞的数量有显著上升(与模型组比较，P=0.00)；而直接灸对Treg细胞数量的影响无显著差异(与模型组比较，P=0.22)。而安慰治疗组和不治疗组Treg细胞的数量与模型组无显著差异(均P>0.05)。与正常小鼠比较，CIA模型小鼠Th17细胞上升(P=0.00)；悬灸治疗后，Th17细胞的数量有显著下降(与模型组比较，P=0.00)；而直接灸组Th17细胞数量的影响无显著差异(与模型组比较，P=0.44)。而安慰治疗组和不治疗组Th17细胞的数量与模型组无显著差异(均P>0.05)。见表2。

表2 流式细胞术分析各组Th17、Treg细胞数量比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05

这说明，悬灸能正向调节胶原诱导的关节炎模型中的Treg/Th17细胞失衡，提高Treg细胞、抑制Th17细胞数量，而直接灸作用不明显。

3 讨论

艾灸治疗的施治方式、技术参数是影响疗效的关键环节。近年来艾灸治疗RA的实验研究中，越来越多地关注了穴位的选择[25]、灸温[27]、时间[28-30]、方法[31]、距离[22]对实验结果的影响，但对施灸方式异同的比较研究并不多见。既往研究艾灸治疗RA的动物实验中，有的研究采用麦粒灸，有的采用艾柱悬灸，两种方式均有一定疗效。那么到底直接灸和悬灸，哪种灸法治疗RA模型动物更好，尚不明了。

回顾相关文献，只有一项研究[31]在实验中比较了温和灸、隔姜灸和直接灸3种不同方法对RA模型兔关节炎的作用，结果发现3种灸法均有明显的抗炎作用，但疗效上隔姜灸作用更明显；不同灸法对下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(Hypothalamic Pituit Aryadvenal Axis, HPAA)功能均有明显的调整作用，但不同灸法比较差异无统计学意义。该结果仍然无法回答直接灸和悬灸对于治疗RA模型鼠尤其是CIA小鼠关节炎孰优孰劣的问题。

本研究首次在CIA小鼠模型上比较了“肾俞”和“足三里”穴直接灸与悬灸治疗的不同效应，并用棉花灸作为安慰对照证实艾灸的作用。结果发现：直接灸和悬灸均能减轻CIA小鼠关节滑膜病变、下调IL-1β、IL-6、IL-17等致炎因子和上调IL-10、TGF-β等抗炎细胞因子含量；说明两者均有一定的疗效。但也观察到，与悬灸治疗比较，直接灸治疗对CIA小鼠关节肿胀有不减反增的作用，并且对于纠正脾Treg/Th17细胞失衡状态无显著作用。这说明悬灸和直接灸的效应还是有不同之处的，直接灸治疗CIA小鼠的疗效和作用机理还需进一步研究。但也有研究[23-24]表明用麦粒灸直接灸疗可改善实验性RA大鼠足趾肿胀程度，其机制可能是通过改善滑膜组织增生与炎症因子的凋亡。上述研究与本研究结果有所不同，可能与选择的实验模型相关。CIA小鼠关节较小，1 mg/壮的麦粒灸刺激量仍显过大，也可能是导致肿胀不减反增的原因。

同时，还有一项研究[32]观察了直接灸、温和灸、隔姜灸3种不同灸法产生的“艾灸血清”的RA模型大鼠膝关节滑膜成纤维细胞的影响，结果发现3组RA滑膜成纤维细胞48 h后均状态变好，形态逐渐接近于正常滑膜成纤维细胞，其中以隔姜灸组最为明显。但该研究为艾灸后的产物——艾灸血清体外作用于培养的成纤维细胞的研究，又不能直接用于说明与其体内的作用是同出一辙。但这项研究中隔姜灸法治疗效果更好的发现与上述研究直接灸、温和灸、隔姜灸一致，也提示应该将直接灸、悬灸、隔姜灸用于CIA小鼠，进一步比较其异同。