针刺治疗慢性不可预见性温和应激大鼠多时间点血清代谢组学的变化*

徐雪娇,李天英,李 欣,马芸瑄,乔延盈,刘俊麟,罗文彬,梁 东

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

随着抑郁症发病率的不断增加，其对人类的危害逐渐显现并且愈发严重。抑郁症的治疗成为人们极为关注的热点。寻找有效的治疗方法刻不容缓。针刺作为中医学的重要治疗手段之一，在抑郁症的临床治疗上具有一定的优势[1-2]。但其机制尚不清楚。2016年美国内科学会临床实践指南提出：单用针刺治疗抑郁症具有疗效好且副作用低的优势[3]。本研究选用经典的抑郁动物模型——慢性不可预见性温和应激(Chronic unpredictable mild stress, CUMS)模型[4]。以往较为重视对治疗结果的研究而忽略治疗过程。本研究选取针刺百会和印堂治疗CUMS大鼠过程中的多个时间点，观察糖水消耗和血清代谢组学的变化，找寻相关代谢通路。为针刺治疗抑郁症提供更加全面的理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

领取30只雄性SD大鼠[黑龙江中医药大学实验动物中心，动物许可证编号：SCXK(黑)2018-003]。适应环境：单笼饲养1周。适应2%蔗糖水溶液：5周。饲养条件：温度：22～23℃，湿度：45%～55%，光照周期：12 h。提供标准食水。

1.2 实验流程

如图1，在蔗糖水溶液适应阶段，每周固定时间进行糖水消耗实验。刺激开始前，将大鼠随机分成CUMS大鼠24只和对照组大鼠6只，将对照组大鼠放置于另外的房间不予刺激并正常喂养。4周的慢性不可预见性温和刺激结束后将CUMS大鼠随机平均分为针刺1周组、针刺2周组、针刺3周组和CUMS组并开始针刺治疗，SPT每周固定时间进行。

图1 实验总流程图

1.3 CUMS流程

本实验采用慢性不可预见性温和应激造模方法[5]。具体操作有空笼，合笼，倾斜鼠笼45°，禁水，空瓶和夜间光照等。每日1～2种刺激，同一种刺激2 d内不重复使用。糖水消耗实验过程中不刺激。

1.4 行为学

1.4.1 糖水消耗实验 糖水消耗实验(Sucrose prefe-rence test,SPT)是CUMS模型评价中的金标准[6]。同时放置外观完全相同的一瓶纯水和一瓶糖水。在实验的中间时间点交换两瓶水的位置。观察规定时间内蔗糖水溶液消耗的百分比。

1.4.2 统计学处理 应用统计学软件SPSS 23.0，采用Student t检验或非参数检验。P<0.05被认为差异具有统计学意义。

1.5 针刺流程

参考相关研究[7],每天上午10点，选取针刺百会(GV20，两耳尖连线中点)和印堂(GV29，两眼连线中点)进行针刺。针具：华佗牌(0.18 mm×13 mm，苏州医疗用品厂有限公司)，先用酒精棉球消毒再进针5 mm，留针20 min。

1.6 取材

7%水合氯醛腹腔注射麻醉后采血，室温下静置25～30 min，离心10 min(3 000 r/min)，吸取上清保存到EP管中，储存于-80℃冰箱。

1.7 GC-MS分析

气相色谱质谱联用(Gas chromotography/mass spectrometry,GC-MS)分析方法基于课题组相关研究[8-9]，具体如下。

1.7.1 样品制备 样本取出并解冻，将50 μL的血清样本移至EP管中加入内标(20 μL,0.3 mg/mL,L-2-氯苯丙氨酸)，加入150 μL甲醇-乙腈(2∶1,v∶v)溶液，持续摇匀，-20 ℃静置约10 min。冰水浴超声5 min，静置10 min(-20 ℃)，离心10 min(4 ℃)，取100 μL上清。加入80 μL甲氧胺盐酸盐吡啶(15 mg/mL)，涡旋震荡2 min后，进行肟化反应。将样品取出并加入80 μL的BSTFA(1%TMCS)和20 μL正己烷进行涡旋震荡(2 min)并于70 ℃发生反应。

1.7.2 色谱条件 选用7890A-5975C气相色谱质谱联用仪(Agilent,USA)。采用不分流模式将样品注入进行分析(1 μL)。经毛细管柱(HP-5MS,30 m×0.25 mm×0.25 μm,Folsom,CA,USA)分离后进入质谱。进样口温度：280 ℃，流速：6.0 mL/min。升温程序：60 ℃，125 ℃，190 ℃，210 ℃，310 ℃。

1.7.3 质谱条件 采用随机连续样本分析。离子源：230 ℃，四极杆：150 ℃，电子能量：70 eV。全扫描模式范围为50～600 m/z。

1.7.4 数据分析 数据经软件(ChromaTOF)预处理后，可导出三维矩阵(CSV格式)，可获得样品的基本信息，其中假阳性数据已除去。进行响应强度峰面积的归一化，矩阵导入软件包。无监督的主成分分析(Principal components analysis,PCA)用于评价样本间的总体情况，有监督的(正交)偏最小二乘法分析(Orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)用于寻找组间差异代谢物。200次排序检验用于验证模型是否存在过度拟合。

2 结果

2.1 针刺百会和印堂对CUMS大鼠糖水消耗的影响

经过慢性不可预见性温和应激后，CUMS大鼠糖水消耗显著降低(P<0.01)。针刺治疗第1周和第2周，针刺大鼠糖水消耗虽然有上升趋势，但与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。针刺治疗3周后，针刺3周组大鼠糖水消耗与对照组比较差异无统计学意义。见表1。

表1 各组糖水消耗值比较

2.2 针刺百会和印堂治疗CUMS大鼠多时间点血清代谢组学的变化

如图2所示，PCA分析尚不能将针刺组与CUMS组区分。进而采用PLS-DA和OPLS-DA分析。其中OPLS-DA分析能将4组明显区分。从排列检验中得出该模型不存在过拟合。OPLS-DA载荷图鉴定出77种差异代谢物。其中28种在CUMS组和针刺3周组差异有统计学意义(P<0.01),且在治疗过程中始终保持升高(F>1)或降低(F<1)的趋势。见表2。

图2 代谢组学分析

表2 4组血清差异代谢物 (n=6)

续表2

2.3 相关代谢通路分析

28种差异代谢物与代谢途径的关联：KEGG和HMDB。确定关联途径的影响值：MetaboAnalyst 3.0。结果显示这些差异代谢物主要参与以下代谢途径：①D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢(谷氨酸，2-氧戊二酸酯)；②丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(N-乙酰基-L-天冬氨酸，谷氨酸，柠檬酸盐，2-氧戊二酸酯)；③甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢(甘氨酸，苏氨酸)。见图3(impact factor≥0.2),代谢途径如图4所示。

图3 关联途径影响值(impact factor≥0.2)

图4 代谢途径

3 讨论

近年来，随着抑郁症给家庭和社会造成的影响日益凸显，其治疗也成为该领域研究的热点，西药治疗具有短期疗效好的优势，但其耐药性的产生以及副作用是不可忽视的。针刺治疗情志病早在《黄帝内经》时期就有记载，《灵枢·癫狂》曰：“癫疾始生，先不乐，头重痛……取手太阳、阳明、太阴，血变而止。”临床上抑郁症采用单纯针刺治疗效果显著，百会和印堂为常用穴位[10]。

CUMS大鼠广泛应用于抑郁症的研究中[11-12]。作为系统生物学的重要组成部分，代谢组学能够检测体液中全部的小分子代谢物，并通过分析检测与模式识别找寻相关的生理病理变化[13]。本研究观察针刺治疗CUMS大鼠过程中血清代谢组学的变化，将治疗前后具有显著性差异且在治疗过程中始终保持升高或者降低趋势的代谢物进行相关通路分析。最终有以下6种代谢物：N-乙酰基-L-天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、苏氨酸、柠檬酸盐和2-氧戊二酸酯参与3条氨基酸代谢通路。

氨基酸代谢紊乱在抑郁症的发生发展中都起到了至关重要的作用[14-16]。N-乙酰基-L-天冬氨酸的主要作用是调节大脑渗透压，在神经元中合成并为神经元损伤的标志，是谷氨酸合成途径中的氨基酸[17]。有研究表明其代谢紊乱与抑郁症的认知障碍有关[18]。针刺治疗CUMS过程中对N-乙酰基-L-天冬氨酸进行调节，提示针刺在治疗抑郁症的同时可能起到保护神经元的作用。

谷氨酸作为脑中最为丰富的游离氨基酸是主要的兴奋性氨基酸。在神经元的存活和分化中起主要作用[19]。有研究表明逍遥散通过减轻谷氨酸诱导的额叶皮质神经元损伤而发挥抗抑郁作用[20]。右侧海马谷氨酸/N-乙酰基-L-天冬氨酸的比值与创伤后应激障碍患者的创伤负荷呈正相关[21]。谷氨酸与N-乙酰基-L-天冬氨酸可以作为针刺治疗抑郁症神经元保护相关机制的切入点。柠檬酸盐、2-氧戊二酸酯与谷氨酸和N-乙酰基-L-天冬氨酸共同参与丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，在针刺治疗过程中均呈下降趋势。提示针刺在治疗抑郁症的过程中对此通路可能具有抑制作用。

苏氨酸为必须氨基酸，甘氨酸为主要氨基酸，甘氨酸是通过丝氨酸和苏氨酸等经肝脏和肾脏代谢而成[22]。氯胺酮的抗抑郁研究结果显示骨骼肌的甘氨酸水平有助于氯胺酮的抗抑郁作用。改善骨骼肌甘氨酸水平可能是抑郁症治疗的新靶点[23]。在抑郁症的发病机理研究中，肠道菌群可能参与诱发了甘氨酸和苏氨酸的代谢紊乱[18]。在针刺治疗CUMS大鼠过程中，笔者发现血清苏氨酸含量持续下降而甘氨酸持续上升，提示针刺治疗过程中促进苏氨酸的代谢从而加速甘氨酸的生成。

本研究找寻针刺治疗抑郁症过程中血清多时间点相关差异代谢物，并进行通路关联。得出针刺治疗CUMS大鼠过程中主要对氨基酸代谢进行调节。下一步笔者将这些数据与同时间点脑组织代谢组学数据进行关联性研究，联合中枢与外周为针刺治疗抑郁症提供更加全面的理论依据。