恢刺“阳陵泉”穴对脑卒中大鼠肌痉挛状态和脑梗死体积的影响*

孙天祎,马良宵,王俊翔,母杰丹,钱 旭,于文颜,宋 越,甘莹莹,田 园

(北京中医药大学，北京 100029)

脑卒中后出现痉挛状态，意味着以大脑为代表的上运动神经元在受到损伤后，失去了其对下运动神经元的调控能力，使原本被抑制的反射得到释放，最终导致肌痉挛现象的发生[1]。肌痉挛是脑卒中患者常见并发症，也是运动功能障碍的重要原因之一[2]。因此，大脑损伤、肌痉挛和运动功能障碍三者之间关系密切。研究发现，脑梗死体积比例较小的大鼠神经功能损伤评分较低，其痉挛程度和运动障碍也相对较轻[3]。由此可见，脑缺血状态的改善对于缓解肌痉挛具有重要意义，二者之间存在的关联可以通过观察脑梗死体积比、Zea Longa神经功能损伤评分、改良Ashworth评分(Modified ashworth scale,MAS)和网屏实验来探寻。

现代医学治疗卒中后痉挛的方法主要包括外科手术、药物治疗与肌内效贴治疗等[4]，但其潜在的手术并发症、毒性反应和皮肤过敏反应等副作用不容忽视。针刺治疗卒中后痉挛安全有效[5-6]，机制研究显示针刺可增加缺血性卒中患者的脑血流量[7]，降低大脑中动脉闭塞(MCAO)模型大鼠的脑梗死体积比，对脑组织起保护作用[8]。运动类刺法强调针刺和运动的有效结合，是治疗痉挛的有效手段[9]。恢刺是《黄帝内经》中记载的主治筋肉拘挛的经典刺法，也是运动类刺法的始源，在缓解中风后患者肌痉挛程度、改善患者运动功能和提高痉挛治愈率等方面发挥了重要作用[10-13]。

本研究借助成熟的卒中后痉挛大鼠模型为研究平台，观察恢刺“阳陵泉”穴对模型大鼠脑梗死体积、肌痉挛状态及运动功能的影响，初步揭示恢刺法的抗痉挛及神经保护作用，为临床制定卒中后痉挛的最佳刺法方案提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康成年SPF级雄性SD大鼠，45只，体质量250～300 g，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK(京)2016-0006]，饲养于北京中医药大学实验动物中心。自然昼夜，自由进食水。采用随机数字表法，将45只大鼠随机分为假手术组(9只)、模型组(18只)和恢刺组(18只)。本研究经北京中医药大学动物伦理审查中心审批(批准号：BUCM-4-2019062701-2048)，对所有动物的操作处理均符合北京中医药大学实验动物伦理委员会规定。

1.2 主要仪器和试剂

0.3%2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸盐缓冲液(AMRESCO，美国)；尼龙线栓(0.36±0.02 mm in diameter, 45 mm in length, 北京沙东生物科技有限公司, 北京);中研太和牌针灸针(0.25 mm×13 mm，北京中研太和医疗器械有限公司，北京);网屏装置(北京智鼠多宝生物科技有限公司，北京)；ImageJ图像分析软件(1.52q，National Institutes of Health，美国)。

1.3 模型制备

采用改进的线栓法制作卒中后痉挛模型[14-15]。大鼠手术前12 h禁食不禁水，称重后用1%戊巴比妥钠(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉。将大鼠仰卧位固定、备皮和消毒，于颈部正中稍偏右行纵向切口约1.5 cm，暴露右侧颈总动脉，并依次钝性分离迷走神经、颈外动脉和颈内动脉，用手术线结扎颈总动脉近心端，并用动脉夹夹闭颈外动脉和颈内动脉。在距离颈总动脉分叉处5 mm左右处行切口，将尼龙线栓经切口缓慢插入，松开夹于颈内动脉的动脉夹，将线栓继续插入颈内动脉，直至稍感阻力，此时线栓插入深度为18～20 mm左右。松开夹于颈外动脉的动脉夹，再在切口远心端结扎颈总动脉以固定线栓，清洗补液后进行分层缝合，最后用青霉素粉末敷于伤口预防感染。术后在伤口处用青霉素进行湿敷，并在腹股沟与腹白线之间行腹腔注射青霉素20 U/d，连续3 d。假手术组除不结扎颈总动脉和不插入线栓外，其余步骤与模型组制作相同。

1.4 模型评价

1.4.1 神经功能损伤评分 采用Zea Longa评分标准[14]对各组大鼠进行神经功能评分，评定模型大鼠的神经功能损伤情况。0分，无神经损伤症状；1分，不能完全伸展手术对侧前爪或后爪；2分，行走时向手术对侧转圈；3分，行走时向手术对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。

1.4.2 痉挛程度评价 以改良Ashworth评分(MAS)[16]为标准评定模型大鼠痉挛程度。根据肢体被动活动及关节屈伸的自由程度分为6级：0级:无肌张力增高，大鼠活动自如；1级:轻度肌张力增高，受累部位被动屈伸至ROM末(肌肉接近最长距离时)有轻度阻力或一过性停顿；1+级，轻度肌张力增高，被动屈伸至ROM后50%范围内(肌肉在偏长的位置时)出现一过性停顿，继续进行始终有轻度阻力；2级:明显肌张力增高，但肢体尚易屈伸，有轻度共济失调；3级:明显肌张力增高，被动活动困难，有中度共济失调；4级:肢体屈伸受限，有重度共济失调。

1.4.3 模型成功标准 大鼠术后第3天(治疗前)Zea Longa评分1～3分且MAS评分1级及以上为卒中后痉挛模型成功标准[17]。

1.5 干预时机及方法

研究[15]显示，模型大鼠的神经功能损伤于术后第3天到达高峰，肌张力于术后第6天和第9天到达高峰，并且二者均从术后第10天开始逐渐减轻。课题组前期研究[18]发现，在术后第3～9天内，大鼠痉挛状态稳定，与上述研究的结果相符。因此，为尽可能地减少大鼠自身恢复因素对实验的影响，干预在术后第3天开始，在术后第9天结束。

取穴：大鼠“阳陵泉”穴位于腓骨头前下方凹陷处[19]。针刺方法：恢刺组以毫针先直刺入大鼠“阳陵泉”穴4～5 mm，再将针退至皮下，向左右方向提插30 s，提针至皮下，持续、缓慢活动踝关节30 s，再将针刺入穴位4～5 mm处留针30 min。假手术组和模型组术后不做治疗处理，但进行与恢刺组相同程度与时间的捉抓、束缚刺激。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 Zea Longa神经功能损伤评分 于造模前、治疗前(术后3 d)和治疗后(术后9 d)对大鼠进行测评，以评定大鼠的神经功能损伤恢复情况。

1.6.2 MAS肌张力评分 于造模前、治疗前(术后3 d)、治疗后(术后9 d)进行测评，以评定大鼠的痉挛程度。

1.6.3 网屏实验运动功能评分 于造模前、术后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d和9 d行网屏实验[3]，以评定大鼠肌力、肌张力及平衡能力等综合运动功能。把大鼠置于水平网面上，在2 s内将网屏缓慢翻转90°至垂直状态并维持5 s，观察大鼠停留的时间。5分:大鼠能够牢牢锁住网屏装置且能够向上爬；4分:大鼠四肢能锁住网线并留在网上5 s；3分:能暂时锁住网线但会滑落一定距离；2分:5 s以内掉落；1分:网屏垂直时即刻掉落。

1.6.4 TTC染色观察大鼠脑梗死体积 治疗结束后，每组随机选取4只大鼠，称重后用1%戊巴比妥钠(1 mL/100 g)腹腔注射，深度麻醉后断头取脑，迅速放入-20 ℃冰箱冷冻约20 min。冻好后取出脑组织，将嗅球、小脑和脑干完全切除，并沿冠状面切割脑组织，间隔2 mm，共6片，将其立即置于0.3%TTC磷酸盐缓冲液中，37 ℃恒温水浴避光孵育20 min，每5 min翻动1次。染色均匀后置于4%多聚甲醛中避光固定24 h，将每组脑切片排列整齐并拍照。采用ImageJ图像分析软件计算每只大鼠脑梗死体积百分比(各切片白色缺血区体积之和/各切片脑片体积之和×100%)。

1.7 统计学处理

2 结果

假手术组9只大鼠健康状态良好，没有死亡；模型组大鼠4只死亡，6只未表现出痉挛，最终纳入8只；恢刺组大鼠5只死亡，4只未表现出痉挛，最终纳入9只。

2.1 各组大鼠Zea Longa神经功能损伤评分比较

造模前各组大鼠、术后假手术组大鼠均未出现任何神经功能损伤症状，Zea Longa评分为0。治疗前，与假手术组相比，模型组与恢刺组Zea Longa评分均显著升高(P<0.01)；模型组与恢刺组的Zea Longa评分无统计学意义(P>0.05)。治疗后，与模型组比较，恢刺组Zea Longa评分显著降低(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠治疗前后Zea Longa神经功能损伤评分比较

2.2 各组大鼠MAS肌张力分级评分比较

造模前各组大鼠、术后假手术组大鼠肌张力均正常，MAS评级均为0级。治疗前，与假手术组相比，模型组和恢刺组MAS分级评分均显著升高(P<0.01)；模型组与恢刺组的MAS分级评分差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后，与模型组比较，恢刺组MAS分级评分显著降低(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠治疗前后改良Ashworth分级评分(MAS)比较

2.3 各组大鼠网屏实验评分比较

造模前各组大鼠运动功能均正常，网屏实验评分均为5分。造模后，与假手术组比较，模型组和恢刺组在术后2 h网屏实验评分均明显下降(P<0.01)。治疗后(术后9 d)，与模型组比较，恢刺组的网屏实验评分明显升高(P<0.01)。随着治疗次数的增加，恢刺组的网屏实验评分逐渐上升的趋势明显，治疗结束后(术后9 d)较治疗前(术后3 d)显著增加(P<0.01)。见表3、图1。

表3 各组大鼠不同时点网屏实验评分比较

注：与同时点假手术组比较，**P<0.01；与同时点模型组比较，##P<0.01；与本组术后3 d比较，△△P<0.01。图1 各组大鼠不同时点网屏实验评分比较

2.4 各组大鼠脑梗死体积比较

从TTC染色后的大脑切片可见，假手术组大鼠两侧大脑半球未受到损伤，模型组和恢刺组大鼠的大脑右半球则均出现了明显的梗死区域。与假手术组比较，模型组的脑梗死体积比明显增大(P<0.01)。与模型组比较，恢刺组的脑梗死体积比明显减小(P<0.01)。见表4、图2。

表4 TTC染色后各组大鼠脑梗死体积比的比较

图2 TTC染色后各组大鼠脑切片缺血区比较

3 讨论

近年来，我国脑卒中的发病率和患病率都明显升高[20]。脑卒中具有高致残率的特点，痉挛性瘫痪是脑卒中患者突出的后遗症之一，严重影响了患者的生活质量[21]。因此，揭示、探讨卒中后痉挛的生物学机制，摸索、推广行之有效的治疗方法，是卒中后康复治疗研究中的重要环节。大量临床研究证明恢刺法对卒中后痉挛疗效肯定[10-13]，但相关领域的基础研究还有待于完善。

卒中后痉挛是大脑局部血液循环障碍所致的神经功能缺损综合征在康复过程中出现的后遗症。因此，本实验采用改进的线栓法阻断大鼠大脑中动脉的血流，来模拟卒中后痉挛的发生过程，制备痉挛模型。经行为学和电生理学评定，该模型可靠性较高[15]。亦有研究发现，该模型大鼠出现肢体痉挛的比例约为50%左右[17,22]。因此，本实验在45只SD大鼠中随机抽取9只作为假手术组，剩余36只均用于造模，以保证模型组和恢刺组有足够的样本量。

毫针刺法和穴位选取是影响针刺疗效的重要因素，选择适合于病症的刺法和穴位对于提高临床疗效至关重要。卒中后痉挛中医多以经筋病论属，可以归于“筋病”“痉证”的范畴，多因“中风”后肝肾阴虚、气血虚衰和脉络闭阻不能濡养经筋而致，表现为筋肉拘急挛缩、关节屈伸不利等。《灵枢·官针》言：“恢刺者，直刺傍之，举之前后，恢筋急，以治筋痹也。”恢刺法是《黄帝内经》中记载的经典刺筋之法，是治疗“筋痹”的特色刺法，强调针刺手法和肢体活动的共同作用。《黄帝内经·灵枢集注》言：“恢，大之也。前后恢荡其筋急”，体现出恢刺法刺激范围较大的特点，与筋病病灶范围较大相契合。研究发现，痉挛状态下肌肉的胶原和弹性组织会发生纤维化，导致肌肉融合，进而加重痉挛[23]。这提示增强对局部痉挛肌肉的活动和松解具有治疗意义，为恢刺法从病变肌腱旁进针、多向透刺行针和配合活动关节等刺法特点提供了一定的疗效依据。恢刺法具有良性的双向调节作用，一方面能缓解肌肉紧张状态，另一方面能激活肌肉功能，可以有效促进患病部位主动肌和拮抗肌由协同运动向分离运动转变，进而缓解肌肉痉挛。恢刺法将针刺和运动有效结合起来，与痉挛性疾病的致病特点相适应，故抗痉挛效应确切[9]。阳陵泉为八脉交会穴之筋会，能够通经活络、舒筋壮骨，是治疗筋病的要穴。通过观察治疗前后中风偏瘫患者的脑功能磁共振成像(fMRI)，显示针刺阳陵泉可以调节特定的脑区活动，对治疗中风具有积极有效的作用，能促进中风偏瘫患者脑功能重塑[24-25]。

在缺血性卒中的模型中，TTC染色经常被用来确定脑梗死区域的大小和快速显示脑缺氧组织的范围[26]。有研究发现，针刺可以显著降低MCAO模型大鼠的脑梗死体积比，提高大鼠的运动功能[27]。本实验结果显示，治疗7 d后，恢刺组大鼠的Zea Longa神经功能损伤评分和脑梗死体积比都明显低于模型组，与上述研究结果相符，提示恢刺法能够有效改善大鼠的神经功能损伤和脑缺血状态，具有神经保护作用。

本实验采用MAS肌张力评分联合网屏实验来综合评价大鼠的肌痉挛状态及运动功能的动态变化。结果显示，随着针刺治疗的推进，恢刺组的网屏实验评分从术后5 d开始显著上升，直至治疗结束呈现出稳步上升的趋势，同时MAS评分亦较治疗前显著降低，说明恢刺法有效地提高了大鼠的平衡运动功能，缓解了大鼠的肢体痉挛，其作用稳定而持续。

临床研究[28]表明，脑血流量的恢复有利于中风患者肢体运动功能的恢复。恢刺法刺激量较大，并结合局部肢体运动，能够调畅全身气血、舒筋活络，对卒中后肌痉挛患者的康复有着较好的疗效[10-13]。本实验亦证实，恢刺法在有效缓解大鼠肌痉挛、协调增强大鼠运动功能的同时，明显改善了大鼠脑缺血的状态，提示恢刺法的抗痉挛作用可能与其对痉挛肌肉局部以及中枢大脑的血流改善均有关，其机制值得进一步探讨。

综上，本实验初步证实，恢刺法可缓解卒中后痉挛大鼠的肌痉挛，提高运动功能，改善脑缺血状态，发挥一定的神经功能保护作用。