电针调控SIRT1对肥胖大鼠肝脏炎症因子IL-6、TNF-α的影响*

周钰点，王雅媛，杨姝瑞，梁凤霞

(湖北中医药大学，湖北 武汉 430061)

肥胖是由多种原因导致的代谢紊乱，近年来肥胖人群数量逐年增长，这多和人们的生活水平提高及生活方式的改变有关。肥胖作为多种疾病的病理基础，已经成为全球健康的重大挑战[1]。SIRT1(Silent Mating Type Information Regulation 2 Homolog 1)属于Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase，HDAC)，是NAD+依赖的去乙酰化酶，最初研究认为它主要参与延长生物寿命和限制热量摄入等生理功能。后来的实验证据表明 SIRT1 与肥胖的多个病理环节密切相关[2]，前期研究证实，电针干预肥胖大鼠可改善其中枢和外周的炎症状态[3-4]，因此笔者在此基础上，使用SIRT1特异性抑制剂联合“标本配穴”电针干预肥胖大鼠，观察电针对肥胖大鼠血清和肝脏IL-6、TNF-α的影响，探讨电针治疗肥胖的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器

微型高速离心机(美国Labnet，型号：C2500-R-230V)；电热恒温培养箱(日本ASONE，型号：ICV-450)；FlexStation 3多功能酶标仪(Molecular Devices)；SIRT1抑制剂Nicotinamide(Meilunbio，货号：MB1661)；大鼠白介素6(IL-6)酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号：E-EL-R0015c)；大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号：E-EL-R2856c)；IL-6(bioss，货号：bs-0782R)、TNF-α抗体(abcam，货号：ab66579)；韩式电针治疗仪( HANS-LH202H型，南京济生医疗科技医疗有限公司)；中研太和牌一次性无菌针灸针(0.30 mm×15 mm，北京中研太和医疗器械有限公司)。

1.2 动物模型与分组

8周龄SPF级Wistar雄性大鼠70只，体质量为(200±20)g(由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：42000600033568)，适应性喂养1周后，随机挑选10只大鼠采用标准饮食喂养(3.8 kcal/g ，含 70%碳水化合物, 20% 蛋白质,10%脂肪)，8周后随机抽取6只作为正常组。其余大鼠给予高脂饮食喂养(5.4 kcal/g，含38.5%碳水化合物,15%蛋白质,46.5%脂肪)，8周后采用随机数字表法从造模成功的大鼠中抽取24只，分成模型组、电针组、针加抑组和抑制剂组，每组各6只。

1.3 模型评价

测定大鼠体质量、肛鼻长，计算Lee’s指数[Lee's Index=(W×1 000)1/3/L，W为体质量(g)，L为肛鼻长(cm),LI的大小反映大鼠体脂的含量],以高脂饮食喂养的大鼠体质量超过标准饮食喂养的大鼠体质量的20%作为肥胖大鼠模型[5]。

1.4 干预方法

1.4.1 正常组 标准饮食，不予干预。

1.4.2 模型组 高脂饮食，不予干预。

1.4.3 电针组 选取中脘、关元、足三里与丰隆。使用0.30 mm×15 mm一次性针灸针，足三里、丰隆穴均直刺3～5 mm，关元穴向剑突方向、中脘穴向耻骨联合方向斜刺 3～5 mm。采用HANSLH202H型电针治疗仪，2 Hz，1 mA，连续波。关元和中脘连接同一输出电极，同侧足三里和丰隆连接另一个输出的两个电极。每日留针10 min，每周治疗3次，共治疗8周。

1.4.4 针加抑组 给予SIRT1特异性抑制剂Sirtinol(1 mg/kg，尾静脉注射给药)[6]，并实施与电针组相同的电针治疗，每周治疗3次，共8周。

1.4.5 抑制剂组 给予SIRT1特异性抑制剂Sirtinol(1 mg/kg，尾静脉注射给药)，每周注射3次，共8周。

1.5 检测指标

1.5.1 体质量、Lee’s指数 在干预前和干预后测量各组大鼠的体质量、肛鼻长并依据前述公式计算Lee’s指数。

1.5.2 血清IL-6、TNF-α含量检测 大鼠处死前心尖取血，使用ELISA法检测血清TNF-α和IL-6含量，具体步骤按照试剂盒说明书操作。

1.5.3 Western blot检测肝脏组织IL-6和TNF-α蛋白表达 取大鼠肝脏组织100 mg并加入1 mL裂解液，碾磨至完全裂解后，4℃离心(12 000 r/min，15 min)。取上清作为蛋白浓度测定,配制分离胶与浓缩胶，然后按顺序加样，电泳90～120 min，之后采用半干转法转膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h。加入一抗4 ℃孵育过夜，使用对应的二抗室温孵育 1 h。使用凝胶成像系统进行显影，以目的蛋白与内参光密度比值比较各组样品的蛋白表达水平。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠体质量比较

干预前，与正常组相比，模型组、电针组、针加抑组和抑制剂组体质量均显著升高(P<0.01),且4组大鼠体质量差异无统计学意义(P>0.05)，提示造模成功。干预8周后，与正常组相比，模型组大鼠体质量显著升高(P<0.01)；与模型组相比，电针组、针加抑组大鼠体质量在电针干预后显著降低(P<0.01)；与电针组相比，针加抑组大鼠体质量较高，但差异无统计学意义(P>0.05)；与抑制剂组相比，针加抑组大鼠体质量明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体质量比较

2.2 各组大鼠Lee’s指数比较

在干预前，与正常组相比，其余各组大鼠的Lee’s指数均显著升高(P<0.01)；干预结束后，各组大鼠Lee’s指数均明显高于正常组大鼠(P<0.01)，提示高脂饮食能诱发并维持大鼠的肥胖状态。与模型组相比，电针组和针加抑组大鼠Lee’s指数降低(P<0.01)；与抑制剂组相比，针加抑组大鼠Lee’s指数降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠干预前后Lee’s指数变化

2.3 各组大鼠血清IL-6和TNF-α含量比较

与正常组相比，其余各组大鼠的血清IL-6和TNF-α含量均明显升高(P<0.05)；与模型组相比，电针组和针加抑组大鼠在电针干预后其血清TNF-α、IL-6含量均明显下降(P<0.05)；与电针组相比，针加抑组和抑制剂组大鼠血清TNF-α、IL-6含量有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；与抑制剂组相比，针加抑组大鼠血清IL-6和TNF-α含量降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清IL-6、TNF-α含量比较

2.4 各组大鼠肝脏组织IL-6和TNF-α蛋白水平比较

与正常组相比，模型组大鼠肝脏组织中IL-6和TNF-α蛋白表达量均显著升高(P<0.01)。与模型组相比，用电针干预过后的电针组和针加抑组大鼠肝脏组织中IL-6和TNF-α蛋白表达量均显著降低(P<0.01)。与抑制剂组相比，针加抑组大鼠肝脏组织中IL-6蛋白表达量降低(P<0.01)，TNF-α蛋白表达量有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表4。

图1 各组大鼠肝脏组织IL-6和TNF-α蛋白水平比较

表4 各组肝脏组织IL-6、TNF-α蛋白相对表达量

3 讨论

中医认为肥胖多属于“痰湿”“脾虚”“胃火”等范畴。《灵枢·逆顺肥瘦》中记载：“此肥人也，广肩腋，项肉薄，厚皮而黑色，唇临临然，其血黑以浊，其气涩以迟。”《类经》曰：“……肥贵人,则高粱之疾也……肥贵之人,每多厚味,夫肥者令人热中，甘者令人中满，热蓄于内，多伤其阴，故为此诸病。”说明肥胖的发生与饮食习惯相关,人体正常的代谢依赖于脾胃的运化及肠道的吸收。国内外研究表明，电针能够从控制进食、促进脂质代谢、缓解炎症、抑制交感神经兴奋性和调节胰岛素信号通路等多个环节影响和治疗肥胖[7-8]。肥胖被认为是一种慢性低水平的系统性炎症，IL-6和TNF-α是已被证实的和肥胖相关的炎症因子[9-10]。研究表明，肥胖者血液循环中的IL-6和TNF-α均是升高的，IL-6在肥胖状态下高度表达，伴随肥胖的加重，巨噬细胞的数量和IL-6的表达也随之增高[11]。肝脏是脂质代谢的重要场所，有研究发现，激活小鼠肝脏细胞炎症因子IL-6和TNF-α的释放，是引起肥胖和胰岛素抵抗的关键因素之一[12]。

SIRT1广泛表达于哺乳动物的肝脏、脂肪、肌肉和下丘脑中，与肥胖的多个病理环节相关[13],现有研究和本课题组前期研究发现[14-15]，电针可以激活下丘脑SIRT1基因和蛋白的表达，抑制下游的NF-κB炎症能量信号通路，同时促进下游抑食欲肽POMC的表达，从而达到抑制摄食、改善肥胖的作用。针灸发挥临床疗效的关键因素在于腧穴配伍，中医理论认为肥胖的基本病机为本虚标实，本课题组在中医理论指导下提出了针灸“标本配穴”法[16]，以正气为本，选用关元、足三里固护先天的肾气与后天的脾胃之气，选用中脘与丰隆祛痰湿之邪,这些穴位也是近年多次被报道的用于治疗肥胖相关疾病的常用效穴[17]。肥胖和胰岛素抵抗作为糖尿病的前期状态和病理基础，尽早对其进行干预符合针灸治未病理论。目前药物治疗肥胖存在较大的副作用，而针灸作为一种绿色诊疗方案，能够避免服用激素类药物带来的不良反应，值得临床推广。

本实验在标本配穴电针的基础上，加用SIRT1特异性抑制剂阻断SIRT1的效应。研究结果表明，与正常组相比，高脂饮食诱导的肥胖大鼠的体质量、Lee’s指数、血清和肝脏IL-6及TNF-α水平均显著升高，这提示肥胖的发生发展可能与炎症因子的释放有关。经过电针的干预，电针组和针加抑组大鼠的体质量、Lee’s指数、血清和肝脏TNF-α、IL-6水平较模型组相比均明显降低；与单纯使用SIRT1抑制剂干预的大鼠相比，针加抑组大鼠的血清和肝脏TNF-α、IL-6水平均明显下降。这提示电针可以改善肥胖状态，抑制炎性反应，同时电针可以逆转SIRT1抑制剂的抑制效应，其机制可能是通过激活STRT1通路的抗炎作用实现的。