SPmRNA在免疫抑制大鼠下丘脑中的表达及针刺的干预作用*

颜培宇,朱志中,王 芳,唐 强

(黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨 150040)

免疫抑制现象存在于多种疾病状态中,如病毒感染、恶性肿瘤、不孕不育、脑血管病及艾滋病等。机体在疾病的状态下,可以出现免疫细胞数量的减少或应答方向的改变、细胞因子表达的异常等。多表现为免疫功能低下、应答性淋巴细胞的数量减少、免疫抑制性因子活性增强。研究证实,针灸可以调整机体的免疫功能,这种调整作用多表现为双向调节。本实验以免疫抑制大鼠为模型,探讨不同穴位针刺干预后免疫抑制大鼠下丘脑 SPmRNA表达的变化,并首创头穴加体穴配合的针刺方法,研究其治疗免疫抑制性疾病的应用前景,为针灸临床治疗提供科学依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

清洁级健康 SD雄性大鼠 25只,体重 200～250 g,由黑龙江中医药大学实验动物中心提供[许可证号scxk(京)2007-0001]。

1.2 主要实验试剂

①环磷酰胺(CTX)：由江苏恒瑞医药股份有限公司提供(批号 09041121);②Real Time PCR(HaiGene,SYBR Green荧光定量试剂盒,由上海西唐生物科技有限公司提供);③化学药品纯乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司,批号 20080319);④Trizol(Invitrogen Corp,USA);⑤cDNA第一链合成试剂盒(HaiGene Corp,China),引物合成由上海英俊合成;⑥荧光定量PCR试剂盒(SYBRGreen,HaiGene Corp,China)。

1.3 主要仪器

荧光定量 PCR仪 ABI7500,ABI Corp,USA;Eppendof 5810R离心机,Eppendof Corp,USA;Biometra–T PCR仪,Biometra Corp.Genm;脱色摇床,上海仪器有限公司;蛋白电泳系统,上海天能。

2 实验方法

2.1 实验分组

采用抽签分组方法,将大鼠随机分为 5组：正常对照组(A组),模型对照组(B组)、模型加头针组(C组),模型加体针组(D组),模型加头针体针组(E组),每组 5只。正常对照组与模型对照组每天捆绑不针刺。

2.2 造模方法

取鼠后,饲养环境控制室温(22±1)℃,12 h光暗交替(7：00～19：00照明)。进入实验室最初 4 d为适应环境期,自由进食和饮水并每日抚摸 2～3 min,以适应实验人员操作。于实验第 5天除正常对照组外,各组均腹腔注射新鲜配制的环磷酰胺注射液,剂量 50 mg/kg体重 3天,第 4天加强注射 1次,制备免疫抑制模型[1]。正常对照组腹腔注射等量生理盐水。

2.3 穴位定位及针刺方法

2.3.1 选穴及定位 选穴：头穴(百会及四神聪)、体穴(足三里、关元)。取穴定位：参照“十一五”国家规划统编教材《实验针灸学》和《腧穴学》大鼠标准穴位图定位及拟人对照法定位。足三里穴区取穴膝关节后外侧,在腓骨小头下约 5 mm处取之。头穴区取穴“百会”在大鼠头顶两耳根连线与前后中线交点(相当于人体百会穴),旁开 4 mm丛刺两针。

2.3.2 针刺方法 各组大鼠绑缚固定,针具选择华佗牌 30号 1寸针灸针[2],各穴进针 3～10 mm,留针 20 min。每隔 5 min进行补法捻针。每日 1次,治疗 7天。

2.4 标本采集

于实验第 8日按 0.5 ml/100g体重剂量大鼠腹腔注射 25%乌拉坦,麻醉后,75%乙醇浸泡灭菌。无菌操作断头取脑组织,生理盐水冲洗,切除下丘脑迅速投入液氮中保存备用。

2.5 指标检测及 Real time-PCR检测方法

2.5.1 RNA提取方法(Invitrogen Trizol reagent) ①组织于液氮条件下研磨粉碎,取 100 mg装入 1.5 ml EP管中;②向每管中加入 1 ml的 Trizol Reagent;③用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀,室温静置5 min;④向上述裂解液中加入 200 ul氯仿,盖紧离心管盖,用力震荡 15 s,待充分乳化溶液呈乳白状(无分相现象)后,室温静置 5 min;⑤12,000 g 4℃离心 15 min;⑥从离心机中小心取出离心管,此时匀浆液分为3层,即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中;⑦向上清液中加入等体积的异丙醇,上下颠倒离心管充分混匀后 20℃室温静置 10 min;⑧12,000 g 4℃离心 10 min;⑨小心弃去上清,缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇 1 ml(切勿触及沉淀),轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁。2～8℃ 12 000 g离心 5 min,弃上清;⑩室温干燥沉淀 5 min,加入 100μl无 RNase的水,55～60℃放置 10 min完成 RNA提取。

2.5.2 反转录反应(HaiGene,cDNA第一链合成试剂盒) 在 PCR管中配制混合液,在 PCR仪上进行以下反应：65℃5 min,然后置于冰上急冷。在 PCR管中加入反转录反应液,在 PCR仪上按以下条件进行反转录反应：30℃ 10 min,42℃ 30～60 min,95℃ 5 min,4℃。

2.5.3 Real Time PCR(HaiGene,SYBRGreen荧光定量试剂盒) 引物：Beta-actin引物使用 HaiGene Human-Mouse-Rat realtime PCR引物。SP基因引物(Genebank No.：J05097)：SP-F：5'-GTTCCTTTCCGTCTCAGATGTG-3';SP-R：5'-CTCCAGGTATGCCGATGTCC-3'。定量 PCR仪：beta-actin标准曲线制作,样品 5倍稀释,即为 1,5,25,125 copy数,扩增结果良好。beta-actin溶解曲线制作,结果良好。P标准曲线制作,结果良好。样品 5倍稀释,即为 1,5,25,125 copy数,扩增结果正常。SP溶解曲线制作,结果良好。

2.6 统计学处理

采用 SPSS13.0统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,各组组间差异采用方差分析,以 P＜0.05作为具有显著性差异的标准。

3 结果

共纳入大鼠 20只进入结果分析(实验过程中麻醉意外死亡 2只、针刺过程中感染死亡 3只)。

实验各组大鼠下丘脑 SPmRNA检测结果：实验结果显示,头穴加体穴组(E组)可明显提高免疫抑制大鼠下丘脑 SPmRNA含量(1.09+0.86),显著高于 B、C、D组(0.95+0.58,0.40+0.14,0.71+0.41;P＜0.05)。结果见表 1。

表1 各组大鼠下丘脑SPmRNA表达情况 (±s)

表1 各组大鼠下丘脑SPmRNA表达情况 (±s)

注：与 B组比较,*P＜0.05;与A组比较,▲P＜0.05。

组别 n SPmRNA A组 4 1.25+0.52 B组 4 0.95+0.58▲C组 4 0.40+0.14▲D组 4 0.71+0.41▲E组 4 1.09+0.86*

4 讨论

SP(substance P,P物质)是一种神经肽类激素,也是一种神经递质,可调节激素的分泌,对淋巴细胞的增殖、免疫球蛋白的合成和细胞因子的分泌也有影响。同时也参与了炎症反应。因此,P物质是神经内分泌和免疫共同识别的信号物质之一[3]。许多因素都能引起内阿片肽释放,以针刺刺激所导致的阿片肽改变最为显著。针刺可以引起中枢及外周内源性阿片肽的释放[4]。P物质属于速激肽家族,广泛分布于中枢和外周组织中,中枢神经系统以纹状体、黑质、下丘脑、缰核、脚间核等处含量最高[5～7]。针刺足三里穴,可以提高正常大鼠的 P物质水平[7];针刺阳明经穴对脑肠肽的调节具有双向性,不同穴位的影响不同,相同穴位对不同部位脑肠肽水平的影响也有差异[8]。环磷酰胺可导致机体出现不同程度的免疫抑制现象,是公认制备免疫抑制模型的方法[1]。中医认为“正气存内,邪不可干;邪之所凑,其气必虚”。中医所认为的虚证与现代医学所认为的免疫力低下、免疫抑制非常相似。故可以采用中医药治疗虚证的方法来治疗免疫抑制性疾病。针刺可以提高机体的免疫功能,常用的腧穴有“足三里 ”、“关元 ”等强壮穴。 “足三里”和 “关元 ”都可以通过神经 -内分泌 -免疫网络调整机体的免疫功能,具有增强机体免疫力、提高机体抗病能力的作用。百会头穴区在临床广泛用于脑血管疾病的康复治疗,取得满意的疗效。实验研究证实：头穴丛刺法具有提高脑缺血大鼠平衡、行走及抓握能力,增强患侧肌力;能够增加缺血半影区微管相关蛋白 -2和突触素的表达;能够增加突触数目,保护神经元突触结构基本完整,增加突触活性区长度及突触后致密物质厚度。但头穴丛刺对免疫抑制机体的免疫功能影响尚未见报道。本实验研究从导师多年的临床经验及研究方向出发,以免疫抑制大鼠为模型,探讨了头穴加体穴配合方法对免疫抑制大鼠下丘脑 SPmRNA的影响。实验结果证实：头穴加体穴组(E组)可明显提高免疫抑制大鼠下丘脑 SPmRNA含量,显著高于 B、C、D组(P＜0.05)。说明头穴加体穴的配穴方法可以显著增强免疫抑制大鼠下丘脑 SPmRNA的表达,并可通过神经 -内分泌 -免疫网络作用于外周组织和血液中的淋巴细胞表面相应受体,提高机体的免疫功能,使免疫抑制机体的免疫低下得到恢复,为针刺临床治疗免疫抑制性疾病提供了有力证据。

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