牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

孙 丹,黄小洁,薛 麒,秦义娴,高月异,孙 淼,刘 丹*

(1.北京市兽药饲料监测中心,北京 102200;2.中国兽医药品监察所,北京 100081)

牛病毒性腹泻病(bovine viral diarrhea disease,BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的一种接触性传染病,以发热、腹泻、消化道黏膜坏死、溃烂、持续性感染等为特征[1-3］。BVD在国内外地区均广泛流行,其致病机制复杂且缺乏有效的治疗手段,给养牛业造成了巨大的经济损失[4-6］。BVDV属于黄病毒科瘟病毒属,是一种长度约12.3 kb的单股正链RNA病毒,在遗传上分为BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3型,其基因型主要由5′UTR区、Npro和E2蛋白编码区决定。E2蛋白是BVDV主要的结构蛋白,位于病毒粒子的表面,是最早产生抗体的囊膜糖蛋白,因此可用于BVD的快速诊断[7-9］。

BVDV基因型和基因亚型众多,给该病的检测和预防带来了严重挑战,特别是持续性感染,加重了该病的传播,因此对患病牛和带毒牛的检测和淘汰非常必要。BVD的检测和鉴定方法主要有病原学检测和血清学检测。病原学检测包括病毒分离、电镜技术、分子生物学检测等;血清学检测包括血清中和试验、琼脂扩散试验、免疫荧光技术和ELISA方法等。其中ELISA方法具有操作简单、特异性强等特点,技术比较成熟,能实现样本的快速和高通量检测,最适于在基层推广使用[10-11］。本研究对BVDV-1标准株C24V株的E2基因进行分析和密码子优化,利用原核表达系统表达E2蛋白,建立基于E2蛋白的BVDV抗体间接ELISA检测方法,以期为BVDV大批量样本的抗体检测和流行病学研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 质粒、病毒和血清 pET22b载体、E.coliBL21(DE3)购自北京擎科生物技术公司;中和试验用BVDV NADL株和MDBK细胞由中国兽医药品监察所保存;BVDV阳性血清和阴性血清、160份BVDV临床样本血清(收集自内蒙古呼和浩特地区和河北张家口地区牛场)、牛副流感病毒3型(BPIV3)阳性血清、牛传染性鼻气管炎(IBRV)阳性血清、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)阳性血清等由中国兽医药品监察所保存。

1.2 主要试剂 IPTG、氨苄青霉素购自Amresco公司;明胶、辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗牛IgG购自Sigma公司;蛋白预染Marker、TMB单组份显色液、终止液、包被液均购自北京索莱宝生物科技有限公司;BVDV抗体ELISA检测试剂盒购自IDEXX公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.3 pET22b-E2原核表达载体的构建 以BVDV-1 C24V株基因序列(GenBank登录号L07496.1)为基础,密码子优化后进行基因合成目的片段,通过同源重组将目的片段亚克隆至pET22b表达载体,经测序鉴定正确后命名为pET22b-E2。

1.4 E2蛋白的表达、鉴定和纯化 pET22b-E2转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),得到的菌液加入IPTG诱导后进行表达测试,确认目的蛋白有表达后进行蛋白的纯化测试。

1.5 间接ELISA方法的优化 以纯化后的E2蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA方法作为基础,分别对影响间接ELISA反应的各个因素进行方阵优化。

1.5.1 确定抗原包被浓度和阴阳性血清稀释度 使用包被液将纯化的E2蛋白稀释为8、4、2、1、0.5 μg/mL 5个稀释度。将阴阳性血清分别做1∶40、1∶80、1∶160和1∶320稀释,封闭液选择1%明胶,酶标二抗作1∶5000稀释,按常规ELISA方法进行方阵滴定试验,用酶标仪测定OD450nm值。以P/N最大且阳性血清OD450nm≥1.0、阴性血清OD450nm≤0.2作为判定最优的标准。

1.5.2 确定最佳封闭液 按照优化的包被浓度和血清稀释度,分别选择5%脱脂奶、1%明胶、10%山羊血清、10%马血清、1%BSA、10%兔血清作为封闭液,按照上述方法和判定标准进行试验,确定最佳封闭液。

1.5.3 确定血清最佳作用方式 将阴阳性血清分别于室温和37 ℃孵育30 min、60 min,测定OD450nm值,确定血清最佳作用温度和时间。

1.5.4 确定酶标二抗工作浓度 将HRP标记的兔抗牛IgG分别作1∶2000、1∶4000、1∶6000和1∶8000稀释,选择已经优化好的条件、确定最佳二抗浓度。

1.5.5 确定酶标二抗最佳作用方式 将酶标二抗分别于室温和37 ℃孵育30 min、60 min,测定OD450nm值,确定酶标二抗最佳作用温度和时间。

1.5.6 最佳底物作用时间的优化 按照已经优化的反应条件,将TMB底物分别避光置室温作用10 min、20 min和30 min加入终止液终止反应,确定底物最佳作用时间。

1.7 ELISA方法的特异性试验 将建立的ELISA方法对BVDV抗体阳性牛血清、IBRV 抗体阳性牛血清、BPIV3抗体阳性牛血清、BRSV抗体阳性牛血清以及BVDV抗体阴性牛血清进行同步检测,根据OD450nm值判定有无交叉反应,以评价建立方法的特异性。

1.8 ELISA方法的敏感性试验 将BVDV阳性血清稀释至 1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400倍,用建立的ELISA方法进行检测,以评估方法的敏感性。

1.9 重复性试验 批内重复性试验:使用同一批纯化的E2蛋白包被酶标板,检测5份不同抗体水平的BVDV阳性血清样品和1份BVDV阴性血清样品,计算变异系数。批间重复性试验:取3块不同时间包被在不同酶标板的试剂盒,检测5份不同抗体水平的BVDV阳性血清样品和1份BVDV阴性血清样品,每份血清做3个重复,计算并分析结果。

1.10 临床样本检测 选取160份临床牛血清样品,应用建立的间接ELISA方法进行BVDV抗体检测,并与微量血清中和试验、商品化试剂盒检测结果进行比较,计算符合率情况。

参照常规方法进行微量血清中和试验:采用96孔细胞培养板培养MDBK细胞至长满单层;将BVDV NADL株病毒稀释至200 TCID50/0.1mL;将待检血清做5倍稀释,取血清200 μL加入200 μL工作抗原,充分混合后置37 ℃作用2 h;取MDBK 96孔细胞板,弃去细胞培养液,每孔加入血清病毒中和液100 μL,每个稀释度重复4孔,至37 ℃吸附1 h后,每孔补加100 μL细胞维持液,继续培养,每日观察细胞病变,第5日进行判定;同时设标准阳性血清、阴性血清和病毒对照。待检血清在1∶5稀释时有2个或2个以上孔的细胞未出现细胞病变判为血清阳性,否则判为血清阴性。

2 结果与分析

2.1 E2蛋白的原核表达 重组质粒pET22b-E2转化BL21(DE3),得到的菌液进行诱导表达,SDS-PAGE鉴定结果显示目的蛋白在40 kD左右出现明显条带,有可溶性表达和包涵体表达两种形式,可溶性表达蛋白经纯化后效果较好(图1A)。Western-blot检测结果表明,重组E2蛋白能与BVDV阳性血清发生特异性反应(图1B)。

A: pET22b-E2诱导表达;1. Marker; 2. pET22b-E2未诱导; 3. 诱导样品上清; 4. 诱导样品沉淀; 5. 可溶蛋白纯化样品B: Western-blot鉴定E2蛋白; 1. Marker; 2. E2蛋白

2.2 间接ELISA方法的方阵优化结果

2.2.1 最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度的确定 由表1可以看出,抗原包被浓度为1 μg/mL、血清稀释倍数为1∶40时,P/N值最大,阳性血清OD450nm≥1.0且阴性血清OD450nm≤0.2,所以确定抗原包被浓度为1 μg/mL,血清稀释倍数为1∶40。

表1 最佳抗原包被浓度和血清稀释度选择

2.2.2 最佳封闭液选择 选择封闭液为1%明胶于37 ℃封闭1 h,P/N值最大且阳性血清OD450nm≥1.0、阴性血清OD450nm≤0.2。

2.2.3 血清最佳作用方式的确定 血清于37 ℃作用30 min时,P/N值最大且阳性血清OD450nm≥1.0且阴性血清OD450nm≤0.2(表2)。

表2 血清最佳作用方式

2.2.4 最佳酶标二抗工作浓度的确定 酶标二抗选择1∶2000时,P/N值最大且阳性血清OD450nm≥1.0、阴性血清OD450nm≤0.2。

2.2.5 酶标二抗最佳作用方式的确定 酶标二抗于37 ℃作用30 min时,P/N值最大且阳性血清OD450nm≥1.0且阴性血清OD450nm≤0.2(表3)。

表3 酶标二抗最佳作用方式

2.2.6 底物作用时间的确定 表4结果显示,底物作用时间为室温20 min时,P/N值最大。

表4 底物最佳作用时间

表5 53份BVDV抗体阴性牛血清OD450nm值

2.4 特异性试验结果 特异性试验结果显示,仅BVDV抗体阳性牛血清检测OD450nm>0.255,其他均为阴性,说明建立的间接ELISA具有良好的特异性,与常见其它的牛血清无交叉反应。

2.5 敏感性试验结果 将BVDV阳性血清连续倍比稀释后,用建立的ELISA方法进行检测,结果显示,阳性血清稀释1600倍时,OD450nm>0.255仍为阳性,表明建立的ELISA方法具有较高的敏感性。

2.6 重复性试验结果 表6和表7结果显示,批内重复性试验和批间重复性试验变异系数均小于10%,表明建立的ELISA方法重复性良好。

表6 批内重复性试验

表7 批间重复性试验

2.7 临床样本检测 对160份牛血清样本,用商品化的BVDV总抗体检测试剂盒进行抗体检验,结果显示阳性92份,阴性68份。对92份阳性样本,用建立的间接ELISA方法检测到阳性血清85份,其中的82份用血清中和试验检测同为阳性;有7份样本两种方法检测均为阴性。对阴性血清68份,间接LEISA方法和血清中和试验检测结果均为阴性。间接ELISA方法与血清中和试验、商品化试剂盒的总体符合率分别为98%和96%。详见表8。

表8 对160份血清样本BVDV抗体检测

3 讨论与结论

BVDV呈世界性流行,我国流行情况更加复杂,给养殖业造成了巨大的经济损失。BDV目前尚无特效药物,国内外主要采取疫苗免疫、病原和抗体检测、清除持续性感染牛、BVDV净化等综合防控措施,因此BVDV抗体监测和疫苗效果评价尤为重要。BVDV抗体检测的标准方法是血清中和试验,但其操作复杂,试验周期较长,敏感性不高,不利于高通量样本检测和基层推广使用。而血清抗体间接ELISA方法具有检测速度快、对试验环境和人员的要求低,且其敏感性高于血清中和试验,结果判定简单,在临床样本检测和疫苗免疫抗体监测等方面能发挥更大的作用。本研究利用大肠杆菌表达系统表达BVDV E2蛋白建立的检测血清抗体的间接ELISA方法,可准确检测血清中的BVDV抗体,特异性强敏感性高,对于大批量临床样本的抗体检测、基层样本筛查及BVDV净化等方面具有重要价值。

目前国内检测BVDV抗体使用的ELISA试剂盒大多为国外进口,存在价格昂贵,进口周期长等劣势。美国IDEXX公司商品化的BVDV总抗体试剂盒,其包被抗原为全病毒抗原,需要繁殖大量病毒并进行密度梯度离心,存在制备工艺复杂、成本高和散毒风险等缺点。本研究借助基因表达和蛋白纯化技术制备BVDV E2蛋白,E2蛋白是BVDV结构蛋白中免疫原性最强的糖蛋白,在结构基因中具有良好的中和抗体能力。将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,克服了全病毒包被的不足之处,建立的间接ELISA方法与商品化试剂盒的符合率高达96%。

包被抗原的反应原性和纯度是影响间接ELISA方法敏感性和特异性的关键。目前已报道的BVDV Erns蛋白表达产物大多以包涵体形式表达,存在目的蛋白损失严重、纯度不高等缺点,本研究通过线性抗原表位预测分析并进行密码子优化,利用大肠杆菌原核表达E2蛋白,E2蛋白主要以可溶性形式在大肠杆菌中高效表达,这一蛋白表达特性获得了高纯化和浓度的包被抗原。本研究建立的间接ELISA方法与血清中和试验的符合率较高,更适于高通量检测,用于BVDV疫苗免疫效果评价和BVDV净化等,具有较好的应用前景。