鸭腺病毒3型荧光RPA恒温快速检测方法的建立与应用

刘孟啸,蔡 姝,刘建钗,赵中伟,孙 宁,曲光刚,苗立中

(1.河北工程大学,生命科学与食品工程学院,河北邯郸 056038;2.华中农业大学,动物科技技术学院、动物医学院,武汉 430070;3.山东绿都生物科技有限公司,山东滨州 256600;4.山东省北镇中学,山东滨州 256200;5.山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州 256600)

鸭腺病毒3型(Duck adenovirus type 3,DAdV-3)是2014年在我国广东的番鸭中分离到的新型鸭腺病毒,其致病力较强,临床剖检的病鸭主要表现在肝脏肿大,斑驳状出血,甚至是坏死,发病率在45%～60%,常常诱发鸭第二次感染,死亡率达到35%以上[1］。根据国际病毒分类委员会(International committee on taxonomy of viruses, ICTV)的分类,DAdV-3属于禽腺病毒属[2］,具有禽腺病毒一般结构[3］,直径在60 nm～80 nm,双链DNA病毒,无囊膜,呈二十面体对称结构。病毒粒子的衣壳有三种结构蛋白,分别是六邻体(Hexon)、五邻体(Penton)和纤突(Fiber)。腺病毒Hexon基因是编码主要表面抗原蛋白,由于该基因保守区域较高[4-6］,常作为靶基因用于检测腺病毒。

目前,DAdV-3的检测方法有很多种,最经典和最准确的是病毒分离鉴定[7-8］,但是检测时间较长,不能满足临床快速检测的需求。分子生物学检测主要有普通PCR[9］、多种qPCR[1,10］方法(例如染料、探针和MGB探针)和环介导等温扩增(LAMP)[11］。2020年,曹秀芸等[8］建立检测DAdV-3的PCR方法,成功扩增出Hexon基因的目的片段。2019年,陈翠腾等分别建立SYBR Green Ⅰ、MGB TaqMan实时荧光定量PCR方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,但依赖于荧光仪器,不方便携带,不能满足现场检测。2020年,陈翠腾[12］建立了LAMP技术应用于DAdV-3的快速诊断,缩短了检测时间,该方法易出现假阳性。上述方法均存在不同的缺点。因此,建立一种能快速,实用的现场检测DAdV-3的方法十分重要。

重组酶聚合酶扩增技术[13-16］是一种利用多种酶参与的核酸恒温扩增技术,RPA技术可以在37 ℃～42 ℃恒温,20 min条件下实现核酸的指数扩增[17-18］,该方法对样本要求低,具有快速、灵敏度高、特异性强的优点,具有良好的应用前景[19-20］。本研究以Hexon基因为目的基因建立了DAdV-3的RPA恒温快速检测方法,能快速、特异地检测到DAdV-3,为现场检测DAdV-3提供有力工具。

1 材料与方法

1.1 毒株和临床样品 鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus, DHV),鸭瘟病毒(Duck plague virus, DPV),鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus, DTMUV),鸭细小病毒(Duck parvovirus, MDPV),鸭呼肠孤病毒(Duck reovirus,DRV)和新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)均由山东省滨州畜牧兽医研究院鉴定及保存。55份鸭组织临床样本来自2018-2020年广东地区鸭养殖场。

1.2 主要试剂 荧光定量八排管、DNA凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自美国OMEGA公司;AXYGEN核酸分离试剂盒购自康宁生命科学有限公司;Primes STAR max Premix,pMD-18T载体、DL2000 DNA Marker,TB Green®Premix Ex TaqTMII等购自TaKaRa公司;RPA恒温检测试剂盒来自先达基因科技有限公司;其他试剂和耗材来自生工生物工程股份有限公司;T4 DNA Ligase来自NEB(北京)有限公司;DH5α感受态细胞本实验室提供。

1.3 引物、探针的设计与合成 参照GenBank中DAdV-3 Hexon基因序列(登录号:KR135164.1, MH349773.1,MH349774.1),根据序列的高度保守区域,利用Primer Premier 5.0引物设计软件结合TwistAmp©DNA分析设计手册设计了特异性引物和探针。引物和探针序列(表1),均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 DAdV-3检测引物和探针

1.4 Hexon基因重组质粒标准品的构建 以DAdV-3的核酸为模板进行PCR扩增,扩增反应体系为:Primes STAR max Premix加入12.5 μL,引物DAdV-F1/DAdV-R4(10 μmol/L)各加入1 μL,DNA模板加入1 μL,补足双蒸水至50 μL。反应条件为:95 ℃ 10 s,55 ℃ 5 s,72 ℃ 10 s,30个循环;72 ℃延伸10 min,16 ℃反应10 min。反应结束后进行1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定;凝胶回收并克隆至pMD18-Tvertor载体上,转化至DH5α感受态细胞中,经菌液PCR鉴定为阳性的菌株,提取质粒,质粒送至上海生工测序鉴定,质粒准确无误后计算拷贝数,质粒DNA-80 ℃保存待用。

1.5 荧光RPA恒温快速检测方法的建立 荧光RPA扩增反应体系为:溶解剂10 μL,DAdV-F1 1 μL(10 μmol/L),DAdV-R4 1 μL(10 μmol/L),DAdV-P 0.3 μL(10 μmol/L),激活剂1 μL,DNA 1 μL,去离子水补足25 μL;将溶解剂、引物、探针和去离子水以混合溶液形式加入到含冻干粉的反应管中,混匀离心,将DNA模板加到反应管中,反应管盖上加入激活剂,上下颠倒混合瞬时离心后,立刻将反应管放置在恒温荧光检测仪上读取荧光值,检测时间为30 s每一周期。反应条件为38 ℃条件下反应20 min。以重组质粒DAdV-18T为模板,以蒸馏水为阴性对照,对该方法的引物对组合,引物浓度,反应温度和反应时间等条件进行优化,判定结果以荧光值最高和检测时间最短选出最佳的检测条件。操作如下:筛选引物组合,引物进行两两组合作为检测的引物对,筛选的引物对在2个浓度梯度(0.5 μmol/L、1 μmol/L),确定最佳引物浓度;最后优化反应温度,设置3个反应梯度温度(38 ℃、40 ℃和42 ℃)。

1.6 DAdV快速检测方法的特异性 以重组质粒DAdV-H-18T、DHV、DPV、DTMUV、MDPV和DRV核酸为模板,同时以RNase水为阴性对照,在最佳反应条件下进行RPA恒温快速扩增,来评估该方法的特异性。

1.7 DAdV快速检测方法的敏感性 将重组质粒进行10倍倍比稀释,选取浓度为1×103、1×102、1×101、1×100、1×10-1copies/μL的5个稀释度质粒,按照优化后的RPA条件进行该方法的敏感性测定,根据所得的Ct值,获得所建立方法的最低检出拷贝数。

1.8 DAdV快速检测方法的重复性测定 以浓度为1×104、1×103、1×102copies/μL模板进行恒温扩增,每个稀释浓度重复三次,根据Ct值计算变异系数,评价该方法的重复性。

1.9 临床样本的检测 对55份临床样品进行检测,按照优化后的RPA方法,同时基于MGB探针的荧光定量PCR方法[21］进行检测。结果进行分析,比较RPA和qPCR方法的符合率。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增和鉴定结果 以提取的DAdV-3DNA为模板进行PCR扩增,1.0%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物(图1),与DL2000 DNA Marker进行比较,获得预期大小约为264 bp明亮目的条带,阴阳性对照组成立。将目的片段回收后克隆至pMD-18T载体,再转化到DH5α感受态细胞中,鉴定阳性菌液(图2)后提取质粒送测序,测序鉴定正确后,命名为DAdV-H-18T。计算该质粒的拷贝数为1.06×1011copies/μL。

M: DL 2000 DNA Marker; 1-3: DAdV-3 amplification

2.2 引物对的筛选 DAdV-3最佳引物组合的结果如图3所示,F1/R4阳性所得荧光值为7200,Ct值05∶30,检测结果为弱阳性,判断该组合为在18 min开始非特异性扩增,检测结果相对较好;F1/R1,F1/R2引物组合阴性起峰较大,检测结果为阳性,该组合不成立;F1/R3,F1/R4引物组合阴性起峰小,F1/R3检测结果较F1/R4差;因此确定DAdVF1和DAdVR4为最佳引物对,用于后续实验。

1: F1/R1; 2: F1/R2; 3: F1/R3; 4: F1/R4; 5: F1/R1 negative;6: F1/R2 negative; 7: F1/R3 negative; 8: F1/R4 negative

2.3 引物浓度的优化 引物浓度梯度分别为0.5和1 μmol/L的优化结果如图4所示,1 μmol/L和0.5 μmol/L出峰时间一致,Ct值为08∶00,1 μmol/L引物浓度的荧光值为5400;0.5 μmol/L的荧光值为7200;根据Ct值小和荧光值高的原则筛选,故最佳引物浓度选择0.5 μmol/L。

A:1 μmol/L;B:0.5 μmol/L;1: Positive control;2: Negative control

2.4 反应温度优化 设置温度梯度为38 ℃、40 ℃、42 ℃,优化结果如图5所示,38 ℃和40 ℃出峰时间最早,Ct值为04:00,38 ℃较40 ℃的荧光值高为6700,42 ℃荧光值最低为5600,Ct为07∶30,故最佳反应温度为38 ℃。

A:38 ℃;B:40 ℃;C:42 ℃;1: Positive control;2: Negative control

2.5 特异性和敏感性试验结果 特异性实验结果如图6所示,该方法只扩增出DAdV-3核酸,其他病毒核酸均为阴性,说明所建立的方法具有良好的特异性。敏感性实验结果如图7所示,该方法最低能够检测到1 copy/μL的标准质粒。

1:103 copies/μL;2:Negative control;3:DHV;4:DPV;5:MDPV;6:DRV;7:IBDV;8:DTMUV

1:103 copies/μL;2:102copies/μL;3:101 copies/μL;4:1 copies/μL;5:10-1copies/μL;6～7:Negative control

2.6 重复性实验 选取三种不同拷贝数(104、103、102copies/μL)的标准质粒作为模板,每个拷贝数为三个重复来验证该方法的重复性,结果如图8所示,拷贝数为104copies/μL时Ct值为07∶00、07∶00、07∶30;拷贝数为103copies/μL时Ct值为07∶30;拷贝数为102copies/μL时Ct值为07∶00、07∶00、06∶30。三个重复Ct值相差不大,该方法的重复性良好。

A:模板拷贝数为104 copies/μL;B:模板拷贝数为103 copies/μL;C:模板拷贝数为102 copies/μL;1～3:阳性模板;4:阴性对照A:104 copies/μL;B:103 copies/μL;C:102 copies/μL;1～3:Positive control;4:Negative control

2.7 临床样本的检测结果 对收集的55份临床样本同时采用所建立的RPA和qPCR进行检测,结果显示,RPA阳性率为65.4%,qPCR的阳性率为50.9%,两种方法的符合率为92.7%(表2)。

3 讨论与结论

2014年以来,我国广东省番鸭发生肝肿胀,坏死及不同程度的死亡为特征的疾病,引起该疾病的病原是新型腺病毒DAdV-3。DAdV-3给我国鸭养殖业造成严重危害,因此建立快速检测方法是控制DAdV-3感染的有效措施之一。本试验针对DAdV-3 Hexon的基因序列设计了2对特异性引物与特异性探针,成功建立了RPA恒温快速检测方法。通过对其检测条件的优化,该方法能在38 ℃、18 min条件下检测到病毒DNA最低含量为1 copy/μL。并且该方法对DAdV-3具有良好的特异性,能准确的检测出DAdV-3,并不会对其他鸭病病原产生交叉反应。该方法的重复性实验结果均表明该方法有良好的重复性。将该方法与qPCR方法同时对DAdV-3临床样本进行检测,结果显示该方法与qPCR符合率可达92.7%。

根据已报道的MGB TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,比较了两种方法的敏感性,探针法最低检测线55拷贝,RPA的敏感性高于MGB TaqMan探针法55倍,探针法检测时间较长,依赖昂贵设备,不适合于现场检测;RPA只需一对引物和探针,检测时间18 min,极大缩短了现场检测时间。临床检测结果显示,RPA阳性率为65.4%大于qPCR的阳性率50.9%。本研究建立的DAdV-3 RPA方法[22］的优点如下:首先RPA引物探针能在5～8个错配的情况下保持实验性能不受影响,而qPCR引物探针出现错配会导致探针失效;其次,RPA检测温度在38 ℃～42 ℃下就能进行,不需要昂贵的仪器。相比PCR方法,省去了热循环过程和昂贵仪器的使用;第三,检测试剂以冻干粉的形式保存,比其他PCR试剂更稳定,更容易运输。

本实验建立的DAdV-3RPA恒温快速检测方法特异性强、敏感性高、简便、快速,为现场快速检测DAdV-3提供有力工具。