基于网络药理学与分子对接探究苦虎益母口服液治疗鸡输卵管炎的作用机制

房思远,赵子玉,荣 轩,朱永明,张世佳,李育明,4,赵兵令

(1.河北农业大学中兽医学院,河北保定 071000;2. 河北维尔利动物药业集团有限公司,石家庄 050200;3. 河北省中兽药产业技术研究院,石家庄 050200;4. 河北维尔利生物科技有限公司,石家庄 050200)

输卵管炎在鸡(Gallusgallus)中发生普遍,表现为产蛋高峰消失,产蛋量减少,蛋品质下降,导致扑杀及治疗成本增加,阻碍了鸡规模化养殖的可持续发展[1］。输卵管炎的诱因为鸡舍环境条件差,为大肠杆菌和沙门氏菌等细菌的滋生创造了有利条件,细菌通过泄殖腔到达输卵管,引起输卵管机能障碍, 卵泡发育不良, 蛋白分泌功能受损, 对鸡的繁殖性能造成极大影响[2］。鸡蛋是人类优质蛋白获取的重要途径,因此蛋鸡输卵管炎的治疗尤为重要。抗生素的滥用不仅会产生兽药残留等一系列问题,更重要的是对人类安全及生态环境等都会造成极大的威胁,而中兽药以其安全性好、毒副作用小、残留量少等优势被视为替抗的重要手段之一。

苦虎益母口服液是本实验室筛选出的治疗蛋鸡输卵管炎的中药组方,由苦参、虎杖、益母草、黄芪、菟丝子几味药组成。苦参为君药,具有燥湿、抑菌、利尿等功效[3］,能够清除输卵管道的炎症,减少炎性渗出物;虎杖为臣药,具有止痛、散瘀、解毒等功效[4］,能够清除生殖道内的淤堵,减轻生殖疼痛;黄芪和菟丝子为佐药具有益气健脾[5］,滋补肝肾[6］的功效,二者合用在促进炎症恢复的同时促进卵泡发育;益母草为使药,具有活血、化瘀、利尿和通路的功效[7］,能够清除生殖道的炎性水肿,减轻产后瘀痛。五种药材合用具有清热解毒、化瘀通络、健肝益气、滋补肝肾之功效,用于治疗鸡输卵管炎能够改善卵泡发育不良,提高产蛋率,减轻炎性渗出等。网络药理学涵盖了包括系统生物学等多门学科,能够揭示药物、成分、靶点和疾病之间的网络联系,能够分析并预测中兽药复方的作用机制,这与中医的整体观念相一致。因而采用网络药理学研究苦虎益母口服液治疗鸡输卵管炎的作用机制并采用分子对接进一步验证,为苦虎益母口服液的下一步研究提供参考依据。

1 数据库平台与方法

1.1 苦虎益母口服液有效成分及目标靶蛋白的筛选

利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,http: ∥tcmspw.com/tcmsp.php),对苦虎益母口服液(苦参、虎杖、益母草、黄芪、菟丝子)进行有效成分的筛选,条件为口服生物利用度(OB≥30%) 和类药性(DL≥0.18),物种为“Gallusgallus”,获取相应的蛋白质靶标,并利用Uniprot数据库(https: ∥www.uniprot.org/)对其名称进行规范化处理。

1.2 苦虎益母口服液-有效活性成分-靶点基因网络关系图构建 利用Cytoscape 3.8.2软件,绘制1.1得到的苦虎益母口服液药物-有效活性成分-靶点基因网络图。

1.3 鸡输卵管炎靶点的筛选 以“Gallusgallussalpingitis”、“Chickensalpingitis”、“salpingitis”、为关键词,在基因数据库(GeneCards,https: ∥www.genecards.org/)、在线孟德尔遗传数据库(OMIM,https: ∥omim.org)、毒理基因组学数据库(CTD,http:∥ctdbase.org/)进行检索,整合并标准化得到的数据,删除重复项。

1.4 苦虎益母口服液与鸡输卵管炎交集靶点的获取 利用微生信平台(http:∥www.bioinformatics.com.cn/),得到1.1获得的药物成分靶点与1.3项获得的疾病成分靶点的共同靶点,生成Veen图。

1.5 蛋白质-蛋白质互作(PPI)网络构建 将从1.4项获得的苦虎益母口服液成分与鸡输卵管炎交集靶点利用基于公共数据库和文献信息的蛋白质相互作用网络数据库(STRING,https: ∥www.string-db.org/)进行PPI网络图的构建,设定物种为“Gallusgallus”,置信度>0.4,并隐藏游离节点,其他指标均为默认值,下载其“tsv”文件。将下载好的“tsv”文件导入Cytoscape 3.8.2软件,构建可视化网络图,并利用软件自身工具Network Analyzer计算Degree值,筛选核心靶点。

1.6 GO和KEGG通路富集分析 将1.4项获得的交集靶点利用DAVID数据库(https: ∥david.ncifcrf.gov/)进行GO功能和KEGG信号通路富集分析,物种选择 “Gallusgallus”,筛选伪发现率<0.05的条目,绘制其条形图和气泡图。

1.7 分子对接 为验证网络药理学分析结果,通过PubChem数据库(https: ∥phbchem.ncbi.nlm.nih.gov)查找关键药物活性成分,并下载其3D结构,保存为“SDF”,作为配体文件,并利用Open Babel(https:∥openbabel.org)转换为moL 2格式。从UniProt数据库中根据关键靶点的Entry值,下载关键靶点的3D结构,保存为“PDB”格式作为受体文件。将处理好的文件分别导入到AutoDock Tools中进行去除水分子、加氢等处理后再利用AutoDock Tools进行分子对接。利用PyMol2.6进行可视化。

2 结果与分析

2.1 苦虎益母口服液-有效活性成分-靶点基因网络关系图构建 通过TCMSP数据库检索,得到苦参有效成分25个,靶点163个;虎杖有效成分10个,靶点86个;黄芪有效成分21个,靶点142个;菟丝子有效成分10个,靶点86个;益母草有效成分8个,靶点70个。合并去重后得到靶点共计77个。将有效成分经Uniport数据库和规范化的靶点导入Cytoscape 3.8.2,实现数据可视化,如图1。并根据其Dgree筛选出排名前10的有效活性成分(表1)。并根据图1靶点的连接Dgree值,获取前10的有效成分作用靶点信息(表2)。

蓝绿色代表有效成分靶点;红色代表药物交集靶点;浅蓝色代表各个药物;绿色代表苦参有效成分;金黄色代表虎杖有效成分;浅紫色代表黄芪有效成分;深紫色代表菟丝子有效成分;蓝紫色代表益母草有效成分Blue-green represents the active ingredient target; Red represents drug intersection targets; Light blue represents individual drugs; Green represents the active ingredient of Sophora; The golden yellow color represents the active ingredient of knotweed; Light purple represents the active ingredient of astragalus; The dark purple color represents the active ingredient of dodder seed; Blue-purple represents the active ingredient of motherwort

2.2 苦虎益母口服液与鸡输卵管炎交集靶点Veen图 通过筛选,去重,将得到的苦虎益母口服液基因靶点77个,疾病基因靶点1102个输入微生信平台,得到Veen图(图2),可看到交集靶点共有35个。包括雌激素受体1 (ESR1)、细胞周期调节因子(CCND1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)等。

图2 苦虎益母口服液与鸡输卵管炎韦恩图

2.3 蛋白互作(PPI)网络构建 将获得的交集靶点输入STRING数据库,隐藏游离节点后下载其TSV文件并导入到Cytoscape 3.8.2软件中进行可视化,该图包括35个节点,130条边,如图3。排名前3的是ESR1、CCND1、VEGFA,分别与20、15、14个蛋白相互作用。Degree值越大,节点越大,颜色也越深,靶点越重要。

图3 苦虎益母口服液与鸡输卵管炎蛋白互作图

2.4 GO功能富集分析与KEGG通路分析 从DAVID数据库中获得GO功能富集分析85个条目,筛选符合伪发现率<0.05的条件后得到相关条目8个,绘制条形图(图4)。包括生物过程(biological process, BP)5个,细胞组分(cellular component, CC)1个,分子功能(molecular function, MF)2个。生物过程涉及到白细胞介素-18、巨噬细胞活化、免疫反应、细胞对异生刺激的反应、RNA聚合酶II启动子转录正调;细胞组分涉及到细胞外间隙;分子功能涉及到干扰素-γ受体结合、细胞因子活性。

图4 苦虎益母口服液GO功能富集分析图

KEGG富集分析共得到通路18条,筛选符合伪发现率<0.05的条件后得到通路10条,绘制气泡图(图5),涉及到细胞衰老、细胞周期、Toll样受体信号通路、C型凝集素受体信号通路、沙门氏菌感染、焦点粘连、FoxO信号通路、NOD样受体信号通路、甲型流感、单纯疱疹病毒1感染等通路。气泡越大,富集到此条目的基因数越多,颜色越红,该条目的伪发现率越低。

图5 苦虎益母口服液KEGG通路富集分析气泡图

2.5 分子对接 使用Autodock软件将具有最高Degree值的3种活性成分包括槲皮素(Quercetin)、山奈酚(Kaempferol)、木犀草素(Luteolin),与PPI网络中的3种核心靶点,包括雌激素受体1 (ESR1)、细胞周期调节因子(CCND1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)对接。结果如表3,其中结合自由能最低的是CCND1-木犀草素(-6.34 kJ/mol),表明木犀草素可能通过CCND1作用进而治疗鸡输卵管炎。配体与受体结合越稳定,两者结合能越低。将结合能排名前3的分子对接结果进行可视化(图6)。

表3 苦虎益母口服液有效成分分子对接结果(前3)

A,CCND1与木犀草素对接图;B,CCND1与山奈酚对接图;C,VEGFA与山奈酚对接图A, CCND1 and luteolin docking diagram; B,CCND1 and kaempferol docking diagram; C,VEGFA and kaempferol docking diagram

3 讨 论

苦虎益母口服液包括苦参、虎杖、黄芪、菟丝子、益母草五味中药。其主要活性成分包括槲皮素、山柰酚、木犀草素、芒柄花素、异鼠李素、β-谷甾醇、7-O-甲基异木糖醇、苦参碱、虎杖苷等。基于网络药理学研究,发现其中Degree值排名最高的3种活性成分是槲皮素、山柰酚、木犀草素,均属于属于黄酮类化合物。黄酮类化合物是一类结构相对均一的化合物,具有保护生殖组织、抗炎、抗菌、抗氧化应激等作用[8］。槲皮素是五味药材共有的成分,Degree值最大。槲皮素具有雌激素样作用,能够增加激素分泌,上调或下调凋亡基因的表达,从而促进生殖器官发育和抑制卵泡凋亡来提高生产性能[9］。此外槲皮素的抗氧化活性主要表现为环境和毒理因素对谷胱甘肽(GSH)、酶活性、信号转导途径和活性氧(ROS)的影响[10］。山柰酚可降低不同类型癌症的发病率[11］,主要是通过增加细胞凋亡来抑制癌细胞的增殖来实现[12］。山奈酚能抑制细胞活力,在鸡胚胎的脉络膜尿囊膜中,山奈酚显著抑制OVCAR-70诱导的血管生成和肿瘤生长[13］。木犀草素的抗炎活性包括抑制促炎介质(如COX-2、NO、IL-6、TNF-α)和调节几种信号通路(NF-KB、AP-1和JAK-STAT),这些信号转导通路通过串扰相互连接,木犀草素可以调节和抑制这些信号转导通路,且木犀草素还具有强大的抗氧化能力,能清除自由基和保护细胞[14-15］。苦虎益母口服液可能通过多种有效活性成分调节机体炎症反应、抗氧化和保护细胞等,达到治疗鸡输卵管炎的目的。

PPI分析结果显示,苦虎益母口服液治疗鸡输卵管炎的靶点主要涉及ESR1、CCND1、VEGFA。雌激素受体(ER)是核受体超家族的成员,主要核受体为ESR1和ESR2[16］。配体结合后,ESR1复合物充当转录因子并与雌激素靶基因(例如PGR)的启动子结合以诱导其表达[17］。ESR1在子宫内膜中的表达占主导地位,雌激素依赖性增殖主要通过ESR1介导[18］。ESR1在鸡胚成纤维细胞(DF-1)细胞中的过表达上调了CYP19A1的蛋白表达,而形成协调CYP19A1表达的潜在调控网络有助于CYP19A1在鸡卵巢卵泡膜细胞中的中表达[19］。此外,ESR1的缺失还会影响传出小管和附睾功能,阻碍离子运输和水重吸收,导致精子异常[20］。CCND1是一种原癌基因,可调节细胞周期G1-S期的进展,细胞周期分析和增殖分析表明,CCND1的近端聚腺苷酸化位点加速了细胞周期并促进了细胞增殖[21］。CCND1诱导母体视网膜母细胞瘤1(RB1)蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化,导致该蛋白的降解。这可能有助于胚层发育过程中母体到合子的过渡后细胞周期进程[22］。且CCND1主要在成年雄鸡睾丸的生精小管内的Sertoli细胞核中表达,在Sertoli细胞的分化和睾丸发育过程中生精小管的形成中起重要作用。VEGFA是一个蛋白质家族的成员,在卵巢组织中研究广泛[23］。VEGFA亚型的生物学效应由两种酪氨酸激酶受体介导,即VEGFR1 (FLT1)和VEGFR2 (FLK1或KDR)[24］。VEGFA是血管生成最重要的调节因子之一,在血管生成和进展中起着至关重要的作用[25］。研究表明卵巢功能依赖于正常的鞘血管系统的建立,而VEGFA是鞘膜血管生成的主要调节因子,鞘血管损伤很可能是卵巢功能障碍的原因之一[26］。

GO富集分析表明,苦虎益母口服液主要通过白细胞介素-18、巨噬细胞活化、免疫反应、细胞对异生刺激的反应、RNA聚合酶II启动子转录正调等生物过程对鸡输卵管炎发挥作用。KEGG富集通路分析表明,调节鸡输卵管炎的主要通路是细胞衰老、细胞周期、Toll样受体信号通路。细胞衰老是一种应激反应,可引发永久性细胞周期停滞并引发深刻的表型变化,如产生生物活性分泌组,称为衰老相关分泌表型(SASP)[27］。SASP持续诱导衰老,甚至在免疫系统受损时适度的衰老水平,可能导致衰老细胞的大量积累,从而引发慢性炎症状态,对邻近细胞和整个生物体产生有害影响。SASP能够激活免疫监视并招募适应性和先天免疫细胞来消除衰老细胞[28］。在衰老过程中,衰老细胞的积累超过了这些细胞的清除能力,并通过SASP相关分子的分泌,导致组织的慢性衰退[29］。细胞周期调节由蛋白质、酶、细胞因子和细胞周期信号通路之间的复杂相互作用网络协调,对细胞增殖、生长和修复至关重要[30］。Toll样受体(TLR)是定义明确的模式识别受体,负责病原体识别和诱导先天免疫反应,感知病原体相关的分子模式(例如脂多糖)并触发基因表达变化,保护宿主免受细菌、病毒及其他微生物的侵害[31-32］。细菌脂多糖(LPS)是 toll样受体4 (TLR4)的配体,诱导粘蛋白mRNA增强母鸡阴道粘膜屏障,在蛋鸡阴道中,LPS上调了粘蛋白的表达,这种粘蛋白表达系统可能在阴道黏膜抗感染的粘膜屏障中起作用[33］。

分子对接结果表明,苦虎益母口服液主要有效活性成分槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)、木犀草素(Luteolin)与关键靶点雌激素受体1 (ESR1)、细胞周期调节因子(CCND1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)结合能均为负值,且构象稳定,结合活性良好。苦虎益母口服液的有效成分可能通过上述的关键靶点发挥治疗鸡输卵管炎的作用。

综上所述,苦虎益母口服液的活性成分,即槲皮素、木犀草素、山奈酚等,可能作用于ESR1、CCND1、VEGFA等多个靶点,调节细胞衰老、细胞周期、Toll样受体信号等多种信号通路,抑制炎症反应、抗炎、抗氧化应激,保护生殖组织,从而实现鸡输卵管炎的治疗。研究采用网络药理学方法和分子对接技术,预测苦虎益母口服液治疗鸡输卵管炎的作用机制,符合中药的组方原则,契合其“多组分、多靶点、多通路”的特点。上述研究也为其进一步的研究提供数据支撑和参考依据。