超高效液相色谱法测定原料药中泰地罗新的含量

汤文利 ,郭玉秋,李有志,赵延东,魏秀丽,王艳芬,赵晓雨,梁 萌,门晓冬,宋祥彬

(1.山东省饲料兽药质量检验中心,山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室,济南 250100;2.山东省蛋鸡技术创新中心,济南 250102;3.山东久隆恒信药业有限公司,山东德州251100)

目前,呼吸系统的高发病率和死亡率是全球猪、牛养殖业面临的主要问题[1-4],我国用于治疗和预防猪、牛呼吸道疾病的大环内醋类药物主要是泰乐菌素、替米考星,但随着长时间的使用,各地都发生了不同程度的耐药现象,且出现多次给药才能见效、用量大、残留多等问题。

泰地罗新作为全新的大环内酯类抗生素产品,是泰乐菌素的衍生物,CAS号328898-40-4,分子式为 C41H71N3O8,熔点为192 ℃,溶于极性有机溶剂 (如丙酮、甲醇等),水中微溶[5],结构式见图1。泰地罗新在生产加工及贮藏过程中会产生泰地罗新异构体,结构式见图2。在中华人民共和国农业农村部公告第391号中含量测定项下,明确规定按外标法以泰地罗新主峰和泰地罗新异构体峰的峰面积之和计算其含量,且由于泰地罗新异构体分子结构、烯醇式理化性质与泰地罗新存在差异,为了控制药物质量、优化药物制剂工艺,均需检测泰地罗新异构体,公告中在有关物质项下规定按峰面积归一化法计算,异构体不得超过2%。

图1 泰地罗新Fig 1 Tildipirosin

图2 泰地罗新异构体Fig 2 Tildipirosin isomer

泰地罗新对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均有较强的抗菌活性[6-8],尤其对引起猪、牛呼吸道系统疾病的病原菌尤为敏感[9-11],对猪、牛的呼吸道疾病具有十分明显的治疗效果,药效强于泰乐菌素和替米考星,而且具备动物专用、用量少、一次给药全程治疗、超长的消除半衰期、生物利用度高和低残留等众多优点[12]。将可以替代泰乐菌素、替米考星以及部分替代氟苯尼考等现用兽药的市场份额,对于遏制耐药性行动、保证畜牧业健康发展具有重要意义。

目前,农业农村部公告第391号中采用高效液相色谱法检测泰地罗新原料中泰地罗新的含量,本文检测泰地罗新主峰相对保留时间23 min,异构体峰保留时间26 min,公告规定运行时间为主峰保留时间的2.5倍,耗时较长,流动相使用量较大,且泰地罗新主峰及异构体峰分离度低。因此,本文研究了超高效液相色谱法(UPLC)对泰地罗新进行快速定量检测,大大缩短了检测时长,提高了检测效率,降低了流动相的消耗,减少了环境污染。流动相体系稳定,超高效方法专属性、重现性、精密度、线性和准确度良好,色谱峰不拖尾、分离度和理论塔板数高,为准确、快速控制泰地罗新质量提供检测依据。

由于泰地罗新含量是通过主峰和异构体峰面积之和进行计算,但此前专利及相关文献报道,均未对泰地罗新异构体峰进行考察,色谱图中也无异构体峰检出。本文对主峰和异构体峰均进行了考察,以异构体峰确定方法检测限、定量限,并对其与主峰的分离度等方面进行了检测,使试验更加科学准确、数据可靠。

1 材料与方法

1.1 试剂 泰地罗新对照品,含量99.3%,购自中国兽医药品监察所;泰地罗新原料,购自山东久隆恒信药业有限公司;乙腈(色谱纯);磷酸二氢钾(分析纯);超纯水;

1.2 仪器 WATERS ACQUITY UPLC 超高效液相色谱仪(美国waters公司,配二极管阵列检测器);Waters E2695 高效液相色谱仪(美国waters公司,配二极管阵列检测器)。

1.3 方法

1.3.1 供试品溶液制备 取供试品75 mg,精密称定,置50 mL棕色量瓶中,加乙腈溶解并稀释至刻度,摇匀,制成1.5 mg/mL的溶液,经0.45 μm的微孔滤头过滤。

1.3.2 对照品溶液制备 取对照品75 mg,精密称定,置50 mL棕色量瓶中,加乙腈溶解并稀释至刻度,摇匀,制成1.5 mg/mL的溶液,经0.45 μm的微孔滤头过滤。

1.3.3 标准储备液的制备 精密称取泰地罗新对照品150 mg(折含量后),加乙腈溶解,并定容至50 mL,配制成3 mg/mL储备液。

1.3.4 线性关系考察 取标准储备液(1.3.3)适量,配制成每1 mL含泰地罗新0.2、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.4 mg的标准工作液。

1.3.5 UPLC测定下色谱操作条件及参数 色谱柱:BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流动相:0.05 mol/L磷酸氢二钾缓冲液(磷酸调pH值至8.2)-乙腈(45∶55);二极管阵列检测器,扫描范围:190～400 nm,检测波长:289 nm;柱温:40 ℃;流速:0.5 mL/min;进样量:1 μL。结果按外标法,以泰地罗新主峰和泰地罗新异构体峰的峰面积之和进行计算。

1.3.6 UPLC测定下重复性试验 取同一批泰地罗新原料,按“1.3.1”项下平行制备6份供试品溶液,在“1.3.5”条件下进行分析,计算其峰面积RSD。

1.3.7 UPLC测定下精密度试验 取一份1.5 mg/mL泰地罗新对照品溶液,按1.3.5色谱条件下重复进样6次,计算峰面积RSD。

1.3.8 UPLC测定下检测限和定量限 取泰地罗新的标准工作液,逐级稀释进样,按上述方法测定,以泰地罗新异构体峰的信噪比S/N≥3作为检测限、S/N≥10 作为定量限。

1.3.9 不同色谱条件样品检测比较 取同一份样品,分别参照农业农村部公告第391号中的方法使用高效液相色谱仪和1.3.5色谱条件下使用超高效液相色谱仪进行检测,对比泰地罗新的含量和色谱参数。

1.3.10 稳定性试验 取同一供试品溶液,于室温下0、2、4、6、8、12、24 h,按“1.3.4”项下方法进样,计算峰面积RSD。

2 结果与分析

2.1 色谱分离 按照1.3.5的色谱条件,使用超高效液相色谱仪测定,泰地罗新对照品和泰地罗新原料样品色谱峰峰形良好,分离度高,主峰保留时间约为4.5 min,异构体峰保留时间约为5.0 min。

2.2 线性 根据色谱图以浓度为横坐标,主峰和异构体峰面积之和为纵坐标分析得出,泰地罗新在0.2～2.4 mg/mL的浓度范围内具有良好的线性关系,线性回归方程为y=3.52×106x-1.81×104,R2=0.9992。其标准曲线见图3。

2.3 重复性试验 取同一批泰地罗新原料,平行制备6份供试品溶液,进样,以泰地罗新主峰和泰地罗新异构体峰的峰面积之和计算,测得泰地罗新峰面积RSD为0.69%,满足实验要求。

2.4 精密度试验 取1.5 mg/mL泰地罗新对照品溶液,重复进样6次,以泰地罗新主峰和泰地罗新异构体峰的峰面积之和计算,测得泰地罗新峰面积的RSD为0.12%,满足实验要求。

2.5 检测限和定量限 以泰地罗新异构体峰的信噪比S/N≥3作为检测限、S/N≥10 作为定量限。

结果表明检测限为0.2 mg/mL,定量限为0.6 mg/mL(图4、图5)。

图4 0.2 mg/mL泰地罗新原料色谱图(UPLC 1 μL)Fig 4 0.2 mg/mL tildipirosin drug substance chromatogram (UPLC 1 μL)

图5 0.6 mg/mL泰地罗新原料色谱图(UPLC 1 μL)Fig 5 0.6 mg/mL tildipirosin drug substance chromatogram (UPLC 1 μL)

2.6 UPLC和HPLC色谱条件下样品检测结果的比较 UPLC和HPLC色谱条件下的主成分平均理论塔板数、保留时间、拖尾因子等参数的比较见表1。

表1 UPLC和HPLC色谱条件下的主成分不同色谱参数的比较Tab 1 Comparison of different chromatographic parameters of principal components under UPLC and HPLC chromatographic conditions

由表1可见,UPLC较HPLC色谱条件下,理论塔板数和分离度提高,拖尾因子、保留时间和运行时间大大降低,减少了所消耗的流动相的体积,完全满足检测要求且效率大幅提升。

下图6-图7为泰地罗新对照品UPLC和HPLC检测光谱图,图8-图11为1.5 mg/mL泰地罗新对照品及原料的UPLC和HPLC检测色谱图。

图6 泰地罗新对照品UPLC光谱图Fig 6 UPLC spectrogram of tildipirosin control

图7 泰地罗新对照品HPLC光谱图Fig 7 HPLC spectrogram of tildipirosin control

图8 1.5 mg/mL泰地罗新对照品UPLC色谱图(1 μL)Fig 8 UPLC chromatogram of 1.5 mg/mL tildipirosin control(1 μL)

图9 1.5 mg/mL泰地罗新原料UPLC色谱图(1 μL)Fig 9 UPLC chromatogram of 1.5 mg/mL tildipirosin drug substance(1 μL)

图10 1.5 mg/mL泰地罗新对照品HPLC色谱图(10 μL)Fig 10 HPLC chromatogram of 1.5 mg/mL tildipirosin control(10 μL)

图11 1.5 mg/mL泰地罗新原料HPLC色谱图(10 μL)Fig 11 HPLC chromatogram of 1.5 mg/mL tildipirosin drug substance(10 μL)

根据表2,使用高效液相色谱仪(参照农业农村部公告第391号)和超高效液相色谱仪(1.3.5色谱条件),对同一样品中泰地罗新的含量分别进行比较,相对偏差小于1%,说明超高效液相色谱法可行有效,结果准确。

表2 UPLC和HPLC色谱条件下泰地罗新含量检测结果Tab 2 Results of content determination of tildipirosin under UPLC and HPLC conditions

通过保留时间和运行时间等方面,选择超高效液相色谱法(UPLC)更加高效。从样品理论塔板数、拖尾因子和分离度等方面,选择超高效液相色谱条件,理论塔板数更高,主峰与异构体峰的分离度更好。

2.7 稳定性试验 以泰地罗新主峰和泰地罗新异构体峰的峰面积之和计算,测得泰地罗新峰面积的RSD为1.0%,说明供试品溶液稳定,实验条件满足要求。

3 讨论与结论

3.1 波长选择 在本试验条件下,利用超高效液相色谱仪PDA检测器对泰地罗新对照品溶液在波长210～400 nm 范围内进行扫描,采集其光谱图,得到泰地罗新在289 nm左右有最大吸收,此与农业农村部391号公告中检测波长一致,相较个别专利中设定的216 nm的波长,提高了检测准确性。

3.2 异构体峰的考察 泰地罗新含量是通过主峰和异构体峰面积之和进行计算,但据此前专利及相关文献报道,均未对泰地罗新异构体峰进行考察,色谱图中也无异构体峰检出。本文对主峰和异构体峰都进行了考察,在重复性(RSD为0.69%)、精密度(RSD为0.12%)和稳定性(RSD为1.0%)等方面进行了检测,并以异构体峰确定方法检测限(0.2 mg/mL)和定量限(0.6 mg/mL),使试验科学准确、数据可靠。

3.3 与农业农村部公告第391号[13]结果对比 采用高效液相色谱法和超高效液相色谱法对不同批次泰地罗新原料进行含量测定,相对偏差都小于1%。在本试验条件下,超高效液相色谱法的优势:1、本方法流速为0.5 mL/min,运行时间10 min,每针运行仅需要5.0 mL流动相,与高效色谱法每针运行需56 mL流动相相比,大大缩短检测用时,节约了试剂、耗材,提高了检测效率,使流动相用量极大减少,废液处理的成本降低,减少了环境污染。2、高效液相色谱法进样量为10 μL或20 μL,本方法采用超高效液相色谱法,进样量为1 μL,且进样浓度较391号公告降低,减小色谱柱的损伤,降低检测成本。3、超高效方法重复性、精密度、稳定性、准确度良好,色谱峰不拖尾,分离度高,理论塔板数高。

本文建立的超高效液相色谱法,准确、快速、环保,可以有效的对泰地罗新含量进行定性和定量的测定。