基于网络药理学探讨治疗乳难中药共同代谢通路

沈冰芳,方 聪,徐小妹,张亚敏,卢雪花,李丽莎,徐榕青,林文津*

(1.福建中医药大学药学院,福州 350001;2.福建省医学科学研究院,福建省医学测试重点实验室,福州 350001)

哺乳动物的乳汁具有营养、免疫保护和信息传递等功能,充足的乳汁是新生动物生存和繁殖的前提,在人类生活成长中乳及乳制品也是主要的营养食物[1]。产后乳汁甚少,或逐渐减少,或全无,不能满足哺乳的需要,称为“产后缺乳”、“乳难”等[2]。中医学认为乳汁为气血所化生,气血源于脾胃水谷精微所化,气血充沛则乳汁充盈。因此,气血虚弱、肝郁气滞、痰浊壅滞及瘀血阻滞是本病的主要病机[3]。

目前的治疗方案中,中医药治疗产后缺乳疗效肯定,在辨证体系和治疗方法上都有较为成熟的经验,理法方药运用独到,中医药治疗此病的前景也越来越广阔[4],中医药对缺乳的研究历史悠久,积累了丰富的文献资料,有很好的临床疗效,无不良反应,安全可靠[5],中医治疗以人为本,辨证论治为核心,通过中药等治疗方法从根本上帮助产妇解决缺乳问题[6]。在防治人畜疾病方面,中草药自古以来被我国人民多有应用,具有纯天然、无残留、多靶点的优点,在众多的中医及中兽医典籍中多具有催乳方药的记载[7]。药典中的增奶、催奶方剂已经被许多兽医名家验证并在临床上普遍应用[8]。如徐灵胎《神农本草经百种录》记载中药材泽泻可去除多种水气之疾,而乳亦水,因此也可用于通乳[9]。在2020年版一部《中国药典》中,关于治疗乳汁分泌不足的中药材多有记载,其中川木通、小通草、飞扬草、王不留行、木通、贯叶金丝桃、禹州漏芦、通关藤、通草、黑种草子、漏芦等均具有促进乳汁分泌的作用,在临床上应用广泛,但当前关于这些药材成分的作用机制方面的研究较少。因此,本文利用网络药理学的方法探讨乳难中药共同代谢通路,为乳难中药的开发奠定基础。

网络药理学作为一门基于系统生物学、生物信息学和高通量组织学的全新学科,在实践中,网络药理学的包括基于数据库的研究网络构建,网络分析搜索关键化合物和靶点,以及实验验证以确保预测结果的可靠性[10]。网络药理学可以系统、全面地观察药物对疾病的影响,从而揭示中医药与疾病之间的复杂关系,网络药理学已成功用于揭示中药在疾病治疗中的潜在活性成分,靶点和机制。基于系统生物学和多药理学的网络药理学被认为是阐明中药多成分、靶点、协同效应和机制的有效工具,为提高药物的临床疗效、降低毒性和阐明药物的多机制提供有价值的信息[11]。本研究通过网络药理学方法,探讨乳难中药的靶点、活性成分,进一步了解治疗该领域的药理机制,促进临床合理用药。

1 材料与方法

1.1 药材

1.2 活性成分及其靶点的筛选 应用中药系统药理学分析平台(TCMSP)(http: ∥tcmspw.com/index.php)、中国知网检索川木通、小通草、飞扬草、王不留行、木通、贯叶金丝桃、禹州漏芦、通关藤、通草、黑草种子、漏芦的所有活性成分。以口服生物利用度(OB) ≥30%,类药性(DL)≥0.18为限制条件进行筛选,利用TCMSP靶点预测功能和Swiss target prediction查询有效成分的作用靶点,然后将所得到的靶点信息用Uniprot数据库(https: ∥www.uniprot.org/),限定物种为人类、牛、羊、猪,将所有靶点进行基因标准化。

表1 2020年版中国药典中具有下乳或通乳作用的中药材Tab 1 Chinese medicinal materials with lactation or lactation effects in the 2020 edition of the Chinese Pharmacopoeia

1.3 乳难疾病靶点的获取 以“difficult lactation”、“lactation disorder”、“breast milk stoppage”为关键词,使用GeneCards (http: ∥www.genecareds.org/)、OMIM (http: ∥www.omim.org/)数据库中分别获取乳难疾病的靶点,删除不同数据库合并后产生的重复基因信息,获得所选活性成分潜在作用靶点。

1.4 药物疾病交互靶点 将收集到的中药靶点和乳难疾病靶点导入 Venny 2.1.0在线平台进行分析,获取“中药-疾病”交互靶点信息,并绘制韦恩图。

1.5 蛋白互作(PPI)网络构建及关键靶点的筛选

将收集到的药物-疾病共同靶点导入STRING数据库(https: ∥string-db.org),选择“Multiple proteins”,并将物种选择为“Homo sapiens”,获得蛋白与蛋白之间相互作用的数据,并将数据导入 Cytoscape 3.9.1软件进行可视化分析,绘制PPI 网络图,并利用其内置network analyzer分析工具分析网络特征参数,包括连接度中心性(Degree centrality, DC)、紧密度中心性(Closeness centrality, CC)、介度中心性(Betweenness centrality, BC)进行关键靶点的筛选。

1.6 靶点GO功能与KEGG富集分析 Metascape平台(http: ∥metascape.org)可对靶点进行通路富集分析,该平台更新及时,整合了GO、KEGG、Uniprot等多个权威的功能数据库,支持对批量基因或蛋白质进行注释、富集分析及构建PPI 网络,GO富集分析可分为细胞成分(CC)、分子功能(MF)和生物过程(BP)三个部分。将关键靶点导入Metascape 平台进行GO及KEGG分析,保存其结果并对其进行可视化。

2 结果与分析

2.1 药物成分及靶点信息 通过各组分的ADME性质来筛选潜在的活性成分,结果获得58个潜在活性分子(川木通3个、小通草2个、王不留行4个、木通8个、贯叶金丝桃6个、禹州漏芦4个、通草3个、漏芦5个、飞扬草14个、通关藤6个、黑草种子3个)。然后依次收集活性化合物及其对应的靶点信息,经过数据筛选找到其对应的靶点蛋白,删除重复和无效值,得到336个药物作用靶点。将药物、药物有效成分及靶点导入至Cytoscape 3.9.1中,构建药物化学有效成分及预测靶点的关系网络图,如图1所示。

2.2 乳难疾病靶点信息 根据GeneCards数据库查询靶点信息,共获得4922个靶点,筛选score>6的基因靶点,结果为1513个,在OMIM数据库中共检索得到739个靶点信息。对各数据库检索结果进行合并,删除重复靶点得到2175个疾病相关靶点。

2.3 药物疾病交互靶点 将获得的2175个乳难疾病靶点与药物的1419个靶点进行匹配,使用Venny2.1.0软件获取两者的交集靶点基因,即为化合物作用于疾病的交集靶点基因,构建“药物-疾病”靶点韦恩图,得到共有靶点158个,如图2所示。

图2 药物-疾病靶点韦恩图Fig 2 Venn diagram of drug-disease targets

2.4 蛋白质相互作用关系网络的构建及关键靶点的筛选 将交集靶点导入String在线数据库,进行PPI分析,获得节点数158个,边数2788条,平均节点度为35.3,平均局部聚类系数为0.581,利用Cytoscape3.9.1对PPI网络进行可视化处理,得到PPI网络图(图3),以节点的大小和颜色的深浅反映degree值的大小,节点越大、颜色越深,所对应的degree值则越大,则该节点在网络中的地位越重要。根据cytoscape3.9.1中的CentiScape2.2进行关键靶点筛选,筛选得到Betweenness Centrality(147.8734),Closeness Centrality(0.0033),degree(35.2911)3个拓扑参数均大于所有节点中位数的靶点共计30个,即网络的关键基因(表2)。

图3 交集靶点的PPI网络图Fig 3 PPI network diagram of intersection targets

表2 拓扑分析30个核心靶点信息Tab 2 Information on the 30 core targets for topological analysis

2.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析 GO富集分析分为生物过程(BP,Biological Processes)、细胞组分(CC,Cellular Components)分子功能(MF,Molecular Functions)三大类。以P<0.01为筛选条件,共获得GO富集分析条目1030个,包括生物过程947个,细胞组分29个,分子功能54个。筛选靠前10个进行可视化分析(图4),其中BP种主要涉及细胞迁移的正向调节、细胞运动的正向调节、细胞成分运动的正向调节等,CC主要涉及对膜筏、膜微区、小窝等,MF主要涉及核受体活性、配体激活的转录因子活性、转录协同调节因子结合等。

图4 GO富集分析图Fig 4 GO Enrichment Analysis Chart

以P<0.01为筛选条件,对30个靶蛋白进行KEGG通路富集,共富集到119条信号通路。根据P值大小筛选前20个绘制气泡图(图5),主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)等。

图5 KEGG通路富集分析气泡图Fig 5 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

3 讨论与结论

中医中药在治疗乳汁分泌不足方面具有独到之处,临床治疗重在疏肝理气、补益气血,兼顾活血祛瘀、通络下乳等,目前临床上有关于治疗乳汁分泌不足的方法有中药口服、中药外敷、针灸和按摩等[14]。川木通性寒,味淡、苦,无毒,适用于慢性尿路感染、风湿性关节炎、喉痹失音、经闭乳少的治疗;木通性凉,味苦,主治小便短赤、淋浊、水肿、遍身拘痛、妇女经闭、乳汁不通;通草用于湿热淋证、水肿尿少、乳汁不下等症,能使阳明经精气生发上达而下乳汁,郑涛[15]等针对通草增加哺乳期乳汁分泌的机制进行了研究;小通草治产后乳汁不足常与王不留行、黄蜀葵根同用[16];王不留行走阳明冲任,功善通利,长于通利血脉治疗血脉不通之乳汁不下[17];飞扬草清热解毒,收敛止痒还可治疗痢疾、淋病、乳汁不足、乳痈、湿疮等疾病[18];贯叶金丝桃常用于肝气郁结,情志不畅关节肿痛,乳痈,乳少等[19];漏芦可通经下乳,临床常用于治疗乳痈肿痛和乳汁不下等症,为治疗乳痈、产后缺乳之良药[20];禹州漏芦《滇南本草》记载其味甘、平,性寒,治乳结红肿硬痛,乳汁不通,乳痈乳岩,攻痈疮[21];黑种草子维吾尔医临床将其用于胸闷气促、乳肿、耳鸣和乳汁减少等病症的治疗[22];通关藤又称为奶浆藤、下奶藤,多用于痰多咳喘、风湿肿痛、疮痈以及产后乳汁不通等症[23]。因此中药在治疗乳汁分泌不足方面有良好的效果,但其成分数百种,对其成分和机制的研究还较少,本研究通过网络药理学系统分析了11味治疗乳难中药的有效成分,构建化合物-靶点网络,分析化合物与靶点的相互作用关系。

通过对药物有效成分进行筛选,共获得58个关键成分,其中化合物-靶点网络中的关键成分是β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇、木犀草素、槲皮素、咖啡酸、松脂酚等。根据PPI网络拓扑学分析预测AKT1、TP53、TNF、IL6、CASP3、IL1B、VEGFA、ESR1、MYC、EGFR等为治疗乳汁分泌不足的潜在关键靶点, AKT1是3种密切相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1、AKT2 和AKT3)之一,称为 AKT 激酶,可调节包括代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成在内的许多过程。AKT1对于调节乳腺中催乳素的合成和分泌有重要作用。ESR1基因在机体性发育以及生殖功能方面发挥显著作用,当其与雌激素结合后可通过乳腺细胞分泌生长因子途径来影响乳腺发育情况,另外ESR1基因具有促进细胞分裂、繁殖和生长能力[26]。

GO富集分析表明,促进乳汁分泌中药材的靶点存在于多种细胞成分,通过KEGG通路富集分析发现,促进乳汁分泌涉及多种通路,一部分基因富集到与癌症和病毒感染有直接关系的通路上,包括癌症通路、癌症中的蛋白聚糖、癌症中的微小RNA等,另一部分负责调控信号通路,包括IL-17信号通路、TNF信号通路等。白细胞介素17(IL-17)是一种高度通用的促炎细胞因子,对各种过程至关重要,包括宿主防御,组织修复,炎症性疾病发病机制和癌症进展。TNF(肿瘤坏死因子)是一种促炎和抗炎细胞因子,可以TNF促进T细胞的活化和增殖,调节免疫应答,发挥抗炎的作用。根据上述合理推测中药治疗乳难疾病与IL-17、TNF等信号通路相关,但具体机制尚不十分明确,有待进一步研究。

综上所述,基于网络药理学对“药物-成分-靶点-疾病”相互作用的网络分析,系统地观察药物对疾病的影响,对中药材治疗乳汁分泌不足的作用机制进行整理和分析了解其化学成分与相关靶点的相互作用,通过富集分析进一步深入探讨其作用机制。本研究为后续开发中药泽泻等兽药治疗动物乳难疾病提供研究基础。