复方中药治疗鸡实验性镉中毒的效果研究

徐 浩,艾 淼,杨 剑,2,宋旭琴,2,欧德渊,2

(1.贵州大学动物科学学院,贵阳 550025;2.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室,贵阳 550025)

镉(Cadmium,Cd)是一种有色重金属元素,随着工业化的发展和人类活动导致环境镉污染越来越严重[1]。镉及其相关化合物可通过环境中的水、空气和土壤进入植物体内,并通过食物链在动物及人体内蓄积,诱导细胞氧化损伤和细胞凋亡,造成组织器官受损[2]。20世纪50年代,日本富山县神通川流域居民由于食用“镉米”而引发“痛痛病”事件[3]。也有研究表明大气镉污染主要通过呼吸道进入人体,当镉进入人体后,它通过红细胞和白蛋白进入血液,然后积聚在肾脏、肝脏和肠道[4]。镉的生物半衰期长达10-30年,进入机体后可持续发挥毒性,损害身体健康[5]。目前普遍采用西药缓解镉对组织器官的损伤作用,降低镉在体内的蓄积,但存在不同程度的不良反应[6]。近年研究发现:中药对镉中毒所致的肝肾损伤、耳损伤有一定保护作用[7-9]。中药治疗镉中毒与西药不同,中药通过多途径多靶点治疗镉中毒,更强调整体性,中药既可通过减少镉吸收加速镉代谢,又可通过抗氧化损伤、增强机体防御力等途径协同治疗镉中毒[10,11]。故本研究以染镉的黑脚麻鸡为试验动物,用复方中药进行治疗,通过体质量、病理学观察、组织器官镉含量及抗氧化功能等测定,对复方中药对镉致鸡内脏及骨骼损伤的保护作用进行研究,为复方中药防治禽类镉中毒提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物 根据加味肾气汤[12]基础上稍加改进的复方中药,主要成分为黄芪、当归、熟地、山萸肉、云茯苓、泽泻、丹皮、肉桂、熟附子、淮山药10味中药,均购自贵州省贵阳市花溪区中医院,执行标准为《中国药典》2015年版一部[13]。置于80 ℃烘箱烘干,粉碎过100目筛保存备用。

1.2 主要试剂 氯化镉(CdCl2·2.5H2O,分析纯,上海化学试剂厂),丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒、一氧化氮(NO)试剂盒、一氧化氮合酶(NOS)试剂盒,均购自上海盈公酶联检测试剂有限公司。

1.3 主要仪器 ICP-MS-X2电感耦合等离子体质谱仪,美国Thermo Fisher公司;Sunrise-Basic Tecan酶标仪,帝肯奥地利有限公司。

1.4 复方中药治疗剂量的确定 本试验以高剂量4.7 g/kg复方中药、中剂量2.35 g/kg复方中药、低剂量0.47 g/kg复方中药饲喂染镉黑脚麻鸡,高剂量中药组体重显著高于染镉组(P<0.05),中剂量与低剂量中药组也高于染镉组,但差异不显著。故本试验剂量为4.7 g/kg为此次试验治疗的剂量。

1.5 分组与处理 将90只30日龄体重相近黑脚麻鸡(购于贵阳市龙洞堡某禽苗批发公司)随机分为3组,30只/组,公母各半,分别为空白对照组、阳性组、中药组,空白组饲喂基础日粮,阳性组饲喂基础日粮+40.31 mg/kg CdCl2,中药组饲喂基础日粮+40.31 mg/kg CdCl2+4.7 g/kg复方中药。各组均分笼常规饲养,温度控制在20 ℃左右,湿度70%左右,自由采食和饮水。饲料组分:粗蛋白质≥16.0%,粗纤维≤8.0%,粗灰分≤8.0%,钙为 0.6%～1.3%,总磷≥0.5%,盐0.2%～0.8%,蛋氨酸≥0.65%,水分≤13.5%。电感耦合等离子体质谱法测得配合饲料内镉含量≤0.201 mg/kg,符合国家饲料卫生标准(GB13078-2001:鸡配合饲料内镉含量≤0.5 mg/kg)。第30 d、60 d、90 d时每组随机取10只鸡,测定体重,采血后处死,采集组织器官。将采集的动物样品先用滤纸吸干水,然后用高速组织捣碎机捣碎后,各样称取约 0.5 g 于消解罐中,再各加入 10 mLHNO3,同时做空白样,拧松盖子置于通风橱内预消解 2 h,再拧紧盖子摇匀,放入微波消解仪中消解。消解结束后,待完全冷却至室温,将消解液用超纯水转移并定容至 50 mL容量瓶中,混匀待检[14]。

1.6 病变观察 常规石碏切片,HE染色后进行病变观察。

1.7 氧化还原指标检测 血清中SOD、GSH-Px、NOS、MDA和NO的采用试剂盒测定,操作方法严格按说明书进行。

1.8 组织器官镉含量测定 心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏、跖骨中镉含量检测均参照张曦[15]文献中ICP-MS法进行。按式计算样品中镉的含量:Xi=(Ci-Cio)×V/m×100,Xi为样品中镉的含量/(mg/kg);Ci为从标准曲线上查得样液中镉的浓度/(μg/L);Cio为从标准曲线上查得空白溶液中镉的浓度/(μg/L);V为样液的总体积/mL;m为样品的质量/g。

1.9 统计分析 试验数据经Excel2010处理后,采用SPSS20.0统计软件分析,结果以“平均值±标准差”表示,结果的差异性分析采用配对样本t检验法,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 复方中药对染镉鸡体重的影响 由表1可知,饲养30 d、60 d和90 d后,阳性组鸡体重均显著低于空白对照组的鸡体重(P<0.05);中药治疗组体重显著高于阳性组鸡体重(P<0.05)。

表1 复方中药对染镉鸡体重的影响 (kg)Tab 1 The Effect of Compound Chinese Medicine on the Body Weight of Cadmium Exposed Chickens (kg)

2.2 复方中药对染镉鸡组织器官病变的影响 阳性组心肌纤维间质内有大量的嗜中性粒细胞和淋巴细胞等炎症细胞浸润,纤维出现紊乱现象,部分出现断裂,并伴有坏死灶(图1-a2);中药治疗组炎症细胞明显减少,心肌纤维断裂现象减少,排列较为整齐,坏死细胞减少(图1-a3)。

A1.空白组心脏;A2.阳性组心脏;A3.中药治疗组心脏;B1.空白组肝脏;B2.阳性组肝脏;B3.中药治疗组肝脏;C1.空白组肺脏;C2.阳性组肺脏;C3.中药治疗组肺脏;D1.空白组肾脏;D2.阳性组肾脏,D3.中药治疗组肾脏;E1.空白组脾脏;E2.阳性组脾脏;E3.中药治疗组脾脏;F1.空白组跖骨;F2.阳性组跖骨;F3.中药治疗组跖骨图1 复方中药对染镉鸡心脏、肝脏、肺脏、脾脏、跖骨组织结构的影响(400×)Fig 1 Effect of Compound Chinese Medicine on the Structure of Heart, Liver, Lung, Spleen, and Metatarsal Bone in Cadmium Exposed Chickens(400×)

阳性组肝脏中央静脉有出血、充血现象,周围有以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润,肝细胞索排列紊乱,肝小叶界限不清(图1-b2);中药治疗组肝细胞索结构变清晰、炎性细胞浸润减少、中央静脉充血现象明显缓解(图1-b3)。

阳性组肺泡内充满大量的中性粒细胞,肺间质炎症细胞浸润,肺泡壁毛细血管扩张淤血,部分肺泡断裂,部分细胞脱落、坏死(图1-c2)。中药治疗组肺泡及肺间质内的炎症细胞明显减少,出血充血现象缓解(图1-c3)。

阳性组肾小球旁的间质内有以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润,部分肾小管结构破坏,近曲小管、远曲小管上皮细胞肿胀,管腔渗出物增多,肾间质内出现出血、充血现象(图1-d2);中药治疗组肾小管受损结构逐渐恢复,肾小球肿胀现象减轻(图1-d3)。

阳性组脾脏出现出血性坏死并伴有炎症细胞浸润(图1-e2);中药治疗组脾脏出血现象减轻,炎症细胞大量减少(图1-e3)。

阳性组中骨小梁纤细且有部分断裂,骨髓腔内造血细胞数量明显减少,部分骨髓腔增大甚至破裂(图1-f2);中药治疗组骨小梁排列较为整齐,骨髓腔内造血细胞数量增多(图1-f3)。

2.3 复方中药对阳性组鸡组织器官中镉含量的影响 30 d,中药治疗组肝脏、肾脏、跖骨的镉含量显著低于阳性组的含量(P<0.05);60 d,中药组心脏、肝脏、肺脏、肾脏、腿骨的镉含量均是显著低于阳性组的含量(P<0.05);90 d,中药治疗组心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、跖骨的镉含量是显著低于阳性组的含量(P<0.05)。见表2。

表2 复方中药对染镉鸡组织器官中镉含量的影响 (mg/kg)Tab 2 Effect of Compound Chinese Medicine on Cadmium Content in Tissues and Organs of Cadmium Exposed Chickens

2.4 复方中药对染镉鸡血清抗氧化指标的影响 由表3可知,对试验鸡进行染镉饲养30 d、60 d和90 d,空白对照组血清中GSH-Px、NOS、SOD的活性NO的含量都是显著高于阳性组的值(P<0.05),血清中MDA的含量显著低于阳性组的含量(P<0.05);在染镉饲养30 d后中药治疗组血清中的GSH-Px、NOS、SOD活性NO的含量都是显著高于阳性组的值(P<0.05),MDA的含量是显著低于阳性组的含量(P<0.05);在染镉饲养60天后,中药治疗组血清中NOS、SOD、GSH-Px的活性NO的含量都是显著高于阳性组的值(P<0.05),MDA的含量为显著低于阳性组的含量(P<0.05);在染镉饲养90天后,GSH-Px、NOS、SOD活性NO含量都是显著高于阳性组的值(P<0.05),MDA的含量都是显著低于阳性组的含量(P<0.05)。

3 讨论与结论

镉可致家禽体重增重减缓甚至负增长,降低饲料转化率[16]。本试验中镉暴露后阳性组鸡体重下降,中药治疗组体重显著高于阳性组,随着治疗时间的延长,中药治疗组的体重逐渐趋近空白对照组的体重。这与吴海涛[17]等用加味肾气汤治疗大鼠慢性镉中毒结果一致,中药治疗组体重增长率优于染镉组。说明本试验选用的复方中药有利于染镉鸡体重的增长,能提高其生长性能,对染镉鸡体重下降起到很好的缓解作用。

通过检测各组织器官之间的镉含量,发现中药治疗组各组织镉含量显著低于阳性组,且其差距随着治疗时间延长而增加,显示出该复方中药缓解镉中毒的时间-效应,饲喂90 d后,中药治疗组肝脏、肾脏的炎症细胞明显减少,出血现象明显减轻;脾脏的萎缩现象得到缓解;心脏、肺脏、跖骨断裂受损的结构得到恢复。相关研究中也发现黄芪多糖能够拮抗铅镉引起的脾细胞凋亡,降低铅镉致鸡脾脏细胞DNA片段化程度,减轻重金属对细胞DNA的损伤[18],绿原酸可与体内的二价重金属镉离子进行螯合,降低血镉水平,拮抗镉中毒引起的氧化应激损伤,对鸡镉中毒引起肝细胞损伤起保护作用[19]。本试验复方中药治疗后各组织器官镉含量都显著低于阳性组,且治疗天数与镉蓄积量呈负相关,可能是该复方中药通过促进镉排出来缓解镉对其各组织器官的损伤。

研究表明,镉暴露会导致机体出现氧化应激,镉既可以促进机体产生氧化损伤,又可以使机体的抗氧化功能受到损害[20],染镉动物肝细胞中GSH-Px和SOD活力下降,而MDA水平升高,肝脏对氧化自由基的消除能力明显下降[21],机体NO浓度升高与活性氧反应生成更高氧化能力的亚硝基自由基,一氧化氮合酶NOS活性增强,产生更多NO而造成氧化损伤[22]。研究发现黄酮类化合物如姜黄素、槲皮素可抑制NOS的活性降低NO浓度而起到抗氧化作用[23]。山药多糖对镉染毒大鼠的肝脏及肾脏氧化损伤具有明显的拮抗作用[24],可提高SOD和GSH-Px的含量,降低MDA的含量,加速镉在肝脏代谢产生自由基的清除[25]。当归多糖改善镉致肝损伤机制则可能与调节参与物质代谢相关的酶活性和调控参与细胞凋亡的相关凋亡蛋白的表达紧密相关[26]。染镉后机体细胞在镉的刺激下可降低SOD的活性同时又产生大量的自由基,引起镉中毒体内自由基量越来越多,而黄芪能抵抗生物膜质过氧化,清除氧自由基,保护染镉的睾丸组织[27]。在本试验中,中药治疗组血清中GSH-Px、NOS、NO和SOD的含量均显著高于阳性组,但MDA的含量显著低于阳性组, 说明该复方中药能够有效升高阳性组鸡血清中的GSH-PX、NOS、NO和SOD的值,并且对于血清中MDA的含量的降低具有一定促进作用,可能与该复方中药中黄芪、当归、山药能够有效升高阳性组鸡血清中抗氧化酶活力,减少脂质过氧化反应产物有关。

本试验复方中黄芪、当归、熟地、山萸肉、云茯苓、淮山药为该复方中药的重要组成成分,具有较强的抗氧化和提高机体免疫力功能,可通过降低镉在组织中的蓄积,清除体内自由基,调节参与物质代谢相关的酶活性来缓解染镉鸡组织器官的损伤,可为复方中药应用于治疗畜禽镉中毒提供一定的参考依据。