兽用鸡源和猪源转移因子与免疫活性相关的多肽分析

黄迪海，盛晓丹，刘 霞，黄 兵，亓丽红，张再辉，秦卓明,*

(1. 山东省健牧生物药业有限公司，济南 250100；2. 济南市动物生物药品工程技术研究中心，济南 250100；3. 山东省农业科学院家禽研究所，济南 250100)

转移因子(Transfer Factor，TF)是由动物淋巴细胞产生的小分子物质，能够将供体的特异性免疫信息递呈给受体淋巴细胞，使其致敏从而激发受体细胞介导的免疫反应，在国内主要作为免疫增效剂使用，对于天然免疫和获得性免疫均有一定的免疫调节作用[1]。动物脾转移因子一般含有多肽、核糖、氨基酸、核苷酸、微量元素等多种成分，商品化的TF口服溶液通常把多肽、核糖含量作为质控指标，但缺乏相应的理论支撑。目前，有关脾转移因子多肽成分的研究报道较少[2]，尤其是缺乏多肽种类、功能及其序列的研究。为此，本文应用质谱色谱法(LC-MS)对兽用鸡脾和猪脾TF的多肽进行鉴定，筛选与免疫相关的多肽进行比较和分析，为转移因子及多肽药物的研发提供思路和参考。

1 材料与方法

1.1 材料 兽用鸡脾TF、兽用猪脾TF，由山东省健牧生物药业有限公司通过冻融、透析法制备，多肽含量≥1 mg/mL，核糖含量≥30 μg/mL；Millipore 10 kD超滤离心管。

1.2 方法 TF溶液用10 kD超滤管10000 r/min离心处理，收集通过的滤液，冷藏；委托中国科学院上海生命科学研究院进行蛋白质鉴定，按照文献[1]的方法，进行溶液内酶解(Trypsin，20 h)，抽提酶解肽段，应用LC-MS法采集多肽碎片的质量电荷比，应用BIOWORKS软件搜索相应的数据库，得到鉴定的蛋白质结果，查询Uniprot数据库，筛选具有免疫活性的蛋白质。

2 结果与分析

2.1 蛋白质与多肽的鉴定概况 兽用鸡脾和猪脾TF分别检测到多肽片段656条和1194条，对应蛋白质512种、554种，包含有特征的蛋白448种、485种，其中，与免疫相关的蛋白分别有30种、40种(表1)。

表1 鸡脾和猪脾TF中的多肽及其分子量分布Tab 1 Peptides and their molecular weight distribution in chicken spleen-derived and pig spleen-derived TF

此外，多肽片段对应的完整蛋白还具有生长发育调节、生物酶解、营养代谢以及维持细胞结构和运动等多种活性。

2.2 免疫活性蛋白质及多肽序列

2.2.1 细胞免疫作用 在鸡脾和猪脾TF中，与细胞免疫活性相关的蛋白质共21种蛋白。其中，鸡脾有8种、猪脾有16种，二者均含有淋巴细胞胞质蛋白(LCP)、白细胞介素-16(IL-16)和胸腺肽β4(TMSB4X)3种蛋白。在细胞免疫的感应阶段，涉及9种蛋白，其中，鸡脾2种，猪脾7种(表2)。在细胞免疫的反应阶段，共涉及11种蛋白，其中，鸡脾5种，猪脾6种(表3)。在效应阶段，共涉及4种蛋白，其中，鸡脾1种，猪脾3种(表4)。

表2 TF中与细胞免疫感应阶段有关的多肽Tab 2 Peptides in TF associated to the cellular immune sensing phase

表3 TF中与细胞免疫反应阶段有关的多肽Tab 3 Peptides in TF associated to the stage of cellular immune response

续表

表4 TF中与细胞免疫效应阶段有关的多肽Tab 4 Peptides in TF associated to the effector stage of cellular immunity

2.2.2 体液免疫 参与体液免疫调节的蛋白有11种，其中，鸡脾有6种，猪脾有5种，二者均含有烯醇酶(ENO1)(表5)。

表5 TF中与体液免疫有关的多肽Tab 5 Peptides involved in humoral immunity in TF

2.2.3 其他免疫调节作用

2.2.3.1 先天免疫 涉及先天免疫调节作用的有15种蛋白，其中猪脾有9种，鸡脾有7种，二者均含有甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(表6)。

表6 TF中与先天免疫有关的多肽Tab 6 Peptides involved in innate immunity in TF

续表

2.2.3.2 多种免疫活性 涉及多种免疫调节作用的有9种蛋白，其中，鸡脾有4种、猪脾有5种，二者均含有信号转导转录激活因子(STAT1)(表7)。

表7 TF中与多种免疫有关的多肽Tab 7 Peptides associated with multiple immunity in TF

2.2.3.3 抗肿瘤活性 涉及多种免疫调节作用的有9种蛋白，鸡脾4种，猪脾5种(表8)。

表8 TF中与抗肿瘤有关的多肽Tab 8 Polypeptides associated with antitumour in TF

续表

3 讨 论

TF中的多肽成分比较复杂，相关研究尚处于探索阶段。Kirkpatrick C H[3]制备了牛源和鼠源特异性TF，测序发现其均含有多肽LLYAQDL/VEDN，且能抑制受体迟发性超敏反应的表达。黄静芳等[4]在猪脾脏制备的脾氨肽口服冻干粉中鉴定出胸腺肽β4，占其多肽总量的0.117%。陈艳菊等[5]从抗乙肝TF中分离到多肽与核苷酸的复合物，该多肽由15种氨基酸组成。本文通过对兽用鸡脾和猪脾TF的多肽鉴定，确定了其含有的潜在免疫活性多肽的氨基酸序列，其氨基酸数量为5～24个，多肽分子量为599.2784～2507.8258 Da。这些多肽对应70余种免疫相关蛋白质，其中，鸡脾和猪脾蛋白分别占其总蛋白数的5.86%和7.22%，二者均含有IL-16、TMSB4X、LCP、ENO1、GAPDH、STAT1等六种蛋白质。多肽序列对相关蛋白质的覆盖率为0.29%～81.2%，其中，覆盖率较高的是胸腺肽β4(81.2%)和抗菌肽(31.54%)。结合黄静芳的报道，推断胸腺肽是TF的主要成分之一，但不同工艺制备的TF，其多肽成分、含量有所差异，可能与脾脏来源、粉碎细度、冻融次数、透析或超滤的孔径和时间等因素有关。

研究发现，TF的免疫活性蛋白质中，涉及细胞免疫21种、先天免疫15种、体液免疫11种、多种免疫活性8种、抗肿瘤9种，这些蛋白主要通过某些信号通路发挥作用，如：TCR或BCR介导的信号通路、非受体酪氨酸激酶信号途径、JAK-STAT、cGAS-STING、及NF-κB信号通路等。

研究表明，某些活性肽可以口服发挥免疫调节作用，比如：脯-甘氨酸环二肽[6]、胶原三肽[7]、牡蛎肽[8]、胸腺蛋白肽[9]、环孢素A等。研究发现，多肽口服进入胃和小肠，有的被消化酶、氨肽酶等降解为游离氨基酸和小肽；有的不被降解，通过细胞紧密连接的细胞旁路径、被动扩散、内吞作用或载体转运系统被小肠吸收[10]。进入细胞的小肽一部分被胞浆中的肽酶水解为游离氨基酸，用于细胞本身代谢合成或被运至体循环；一部分具有抗水解酶活性的多肽可直接通过基底侧的肽转运体完整地转运至体循环发挥作用，后被血浆中的可溶性蛋白酶降解为氨基酸[11]。鸡脾和猪脾转移因子中含有免疫活性蛋白的多肽片段达100多种，但尚不能确定哪些多肽片段具有口服免疫活性，还需要进一步通过多肽合成和免疫学试验研究来证实。

除多肽外，TF中还包含核糖、微量元素、游离氨基酸以及核苷酸等多种成分。其中核糖在TF中的含量不低于30 μg/mL，核糖是RNA的组成物之一，也是ATP及NADH等生化代谢所需分子的原料，因其分子量较小，一般不具备免疫原性；微量元素和游离氨基酸是基本营养代谢所需，锌、铜具有一定的免疫调节作用，但其含量仅有0.49 μg/mL和0.04 μg/mL[12]，正常剂量难以发挥免疫功能。TF中核苷酸含量达200～300 μg/mL[13]，其免疫活性成分可能是尿嘧啶类化合物[14]，钱微等[15]也证实了对早期玫瑰花结形成具有显著促进作用的TF成分中含有鸟苷酸、尿嘧啶和尿苷。TF中的核苷酸可能具有口服免疫活性，因为外源食物DNA在小鼠胃肠道中是不完全降解的，其碱基片段可在小鼠进食后的8 h在血液中检测到，24 h内可在淋巴细胞中检出，24 h后发生降解[16]。外源DNA口服后，经非序列依赖性DNA结合蛋白内吞入细胞核，一部分发生降解，未降解的DNA则插入细胞基因组DNA中，可能导致某些外源基因的表达，也可能被机体通过甲基化方式进行控制和清除[17]。TF中的核苷酸主要来自脾脏本身，也可能来自脾脏携带的微生物，其种类和序列有待于应用PCR扩增和高通量测序方法进行鉴定，进而研究其体内外的生物活性。