环糊精修饰的氟苯尼考PLGA纳米粒的制备及其体外释放评价

何怡娇，李姝琪，高崇凯，易 军，李晓芳，吴 芳，林博璇，邓 洵，黄智龙，郭波红*

(1.广东药科大学药学院，广州 510006；2.广东润华药业有限公司，广东 揭阳 515500)

氟苯尼考(florfenicol, FF)是一种硫代苯酚的氟化物类似物，是一种对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均有效的广谱兽用抗生素，具有无潜在再生障碍性贫血作用等优点[1]，被广泛应用。但是，FF的水溶性差，生物利用度低，血浆半衰期缩短，给药后迅速释放，这些缺点给临床应用带来很多不便[2-3]。因此，采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]作为载体材料来改善氟苯尼考成药性缺陷，PLGA纳米粒可以提高药物在体内的稳定性，延长药物体内作用时间，减小药物的副作用，提高药物溶解度和生物利用度。

因材料本身的局限性，单一的纳米载体材料往往会产生稳定性较差，突释效果明显，靶向作用较弱等缺点[4]。将亲水性包覆材料与疏水性纳米材料相结合可避免这种缺点，疏水性的纳米材料作为内核可以装载药物，提升药物的溶解度，亲水性物质进行包覆的外层可保护内部的药物，可以延长药物半衰期，控制药物的释放，提高药效以达到期望的治疗效果[5-7]。环糊精(Cyclodextrins, CDs)是一种外表面亲水、内腔疏水的环状低聚糖，可通过疏水侧链与药物相互作用形成包合物，从而提高药物的溶解度[8]。它与PLGA结合形成的共聚物，可以减少初始爆破释放，延长药物在体内的停留时间来达到长循环的目的，通过不断释放活性物质发挥药物储层的作用，提高亲水性和稳定性，可以提高其载药能力来提高药效，显示出在药物输送系统方面的巨大潜力[9-11]。

选用生物相容性好的PLGA作为制备纳米粒的载体材料，采用亲水性包覆材料2-羟丙基-β-环糊精(2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin, 2-HP-β-CD)对纳米粒进行修饰，利用简单易行的乳化溶剂挥发法，单因素试验考察及正交设计优化FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs，并研究2-HP-β-CD对纳米粒粒径与电位、包封率、体外释放等的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器 安捷伦1200高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限公司)；KQ2200DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；PRACTUM124-1CN电子天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司)；SCIENTZ-ⅡD超声波细胞粉碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；DelsaTM Nano C 粒径分析仪(美国 Beckman Coulter公司)；PKZ-1电热恒温振荡水槽(上海精密实验设备有限公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 材料 FF原粉(99.50%，山东国邦药业股份有限公司)；FF 对照品 (含量 99. 90 %，批号: K0301703，中国兽医药品监察所)；聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA，LA/GA=50/50，相对分子量：10000/20000；LA/GA=75/25，相对分子量：10000/20000，山东省医疗器械研究所)；聚乙烯醇(PVA，德国Sigma-Aldrich公司)；2-HP-β-CD(美国Sigma Aldrich公司)；葡聚糖凝胶(Sephadex G-50，北京索莱宝科技有限公司)；透析袋，MWCO：8000～14000(广州市齐云生物技术有限公司)；乙腈、甲醇(色谱纯，Dikma公司)；二氯甲烷、丙酮(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。

1.3 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的制备 采用改进的乳化-溶剂挥发法[12]，精密称取一定量的FF和PLGA，溶解于适量的丙酮：二氯甲烷(3:2)的混合溶剂中构成有机相，探头超声(超声功率为380 W)作用下将上述溶液缓慢滴加到含有PVA和2-HP-β-CD的水相中，继续超声一定时间得白色乳液，旋转蒸发除去有机溶剂，然后经0.22 μm微孔滤膜过膜整粒，即得FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs。

1.4 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs制备工艺的单因素试验

1.4.1 乳化剂浓度筛选 固定其他制备条件保持不变，改变处方中的PVA浓度，将PVA浓度依次设置为1%，2%，3%，4%，根据“1.3”项下制备方法，测定FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs包封率的情况。

1.4.2 药脂比筛选 固定其他制备条件保持不变，改变药脂比分别为1∶2，1∶5，1∶10，1∶20，根据“1.3”项下制备方法，测定FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的包封率的情况。

1.4.3 药物浓度筛选 固定其他制备条件保持不变，改变处方中FF浓度依次为1.5 mg·mL-1，2.0 mg·mL-1，2.5 mg·mL-1，3.0 mg·mL-1，根据“1.3”项下制备方法，测定FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs包封率的情况。

1.4.4 2-HP-β-CD浓度筛选 固定其他制备条件保持不变，改变处方中2-HP-β-CD浓度依次为1%，1.5%，2%，2.5%，根据“1.3”项下制备方法，测定FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs包封率的情况。

1.5 正交试验设计优化 在单因素试验考察的基础之上，本试验选取PVA浓度(A)，药物与PLGA用量比(B)，FF浓度(C)，2-HP-β-CD浓度(D)四个因素，固定有机相与水相体积比为1∶8，采用L9(34)正交设计表进行正交试验，进一步优选出FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs制备处方。

表1 正交试验水平因素表Tab 1 Orthogonal test level factors table

1.6 FF含量测定

1.6.1 色谱条件 色谱柱：DIKMA Diamonsil©C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流动相：乙腈∶水=35∶65(V/V)；检测波长：224 nm；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；进样体积：20 μL。

1.6.2 方法学考察 精密称定干燥的FF对照品适量置于10 mL容量瓶中，用流动相配制成浓度为500 μg·mL-1的FF对照品储备液。精密量取FF对照品储备液适量，用流动相稀释配制成为10、30、50、80、100 μg·mL-1的标准溶液，按“1.6.1”项下条件进行分析测定(进样经0.22 μm微孔滤膜过滤)。配制低、中、高浓度FF对照溶液，一天内重复测定 6 次，连续测定 3 d，计算日内和日间精密度及 RSD值，另取空白纳米粒分别加入低、中、高浓度FF对照溶液，加适量乙腈充分振摇破乳， 用流动相定容后经微孔滤膜过滤测定，计算回收率。

1.7 包封率测定方法 精密吸取FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs胶体溶液0.5 mL，加样于Sephadex G-50柱(1.3 cm×25 cm)，用蒸馏水洗脱，弃去前10 mL，收集游离药物部分20 mL，60 ℃水浴挥干，残渣用流动相溶解，定容至10 mL，微孔滤膜过滤后取20 μL，进样测定，代入回归方程计算W游离。另取0.5 mL置10 mL量瓶中，加入适量乙腈充分振摇破乳，用流动相定容，微孔滤膜过滤后取20 μL进样测定，代入标准曲线计算W总，计算FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的包封率。

包封率=(1-W游离/W总)×100%

W总：总药物量，W游离：游离药物量

1.8 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的粒径与Zeta电位观察与测定 取适量FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs胶体溶液置于DelsaTM Nano C激光粒度分析仪，测定粒径，多分散指数(polydispersity index, PDI)和Zeta电位。

1.9 体外释放行为研究 体外释放研究在磷酸盐缓冲盐溶液(PBS，pH7.4)中通过透析法进行[13]，具体方法如下：将含有游离FF或FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs(相当于FF 2 mg)的样品溶液加入截留分子量为8000～14000的透析袋中，将透析袋两端密封，放入含有PBS释放介质的锥形瓶中，并放入电热恒温振荡水槽中37 ℃恒温振荡。按预定的时间间隔，吸取2 mL释放介质按照“1.6.1”方法进行分析，并添加2 mL新鲜PBS缓冲液。测定FF累积释放量，并且计算累积释放率。结果一式三份，以累积释药百分率(%)为纵坐标对时间(h)为横坐标作图。

为进一步阐明FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的释药特性，对FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs分别采用零级动力学方程、一级动力学方程、Higuchi 方程、Ritger-peppas方程和Weibull方程进行拟合。具体方程如下：

零级级动力学方程:Q=Kt

一级动力学方程:ln(1-Q)=-Kt/2.303+lnM

Higuchi方程:Q=Kt1/2

Ritger-peppas方程:Q=Ktn

Weibull方程:lnln(1/(1-Q/100))=mlnt-lnt0

其中Q为累计释放百分数，K为释放速率常数，t为时间，M为常数，n为扩散系数，m为形状参数，t0为尺寸参数。

1.10 数据统计与分析 所有试验至少重复3次，数据以“平均数±标准差”表示，使用SPSS13.0统计软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 乳化剂浓度筛选 结果表明，当PVA浓度由1%增加到2%时，纳米粒的包封率由37.23%逐渐升高至61.07%，但继续增加PVA浓度至4%时，其包封率下降至36.48%。原因可能是在一定范围内PVA浓度的升高提升了乳化效果，使纳米粒产率增加；但当PVA浓度继续增大，会使药物更容易扩散到水相，致使包封率开始下降。因此可选择PVA浓度范围为1.5%～2.5%。

2.2 药脂比筛选 结果表明，当药脂比由1∶2增加至1∶10时，纳米粒的包封率由29.48%逐渐升高至59.75%，但继续增加药脂比至1∶20时，其包封率下降至53.75%可能是当PLGA浓度逐渐提高时，纳米粒的产率也逐渐增加，使包封率提高；其浓度过高会导致胶体溶液黏度过高，形成团聚，导致包封率减小。因此可选择药脂比范围为1∶10～1∶20。

2.3 药物浓度筛选 结果表明，随着药物浓度由1.0 mg·mL-1增加至1.5 mg·mL-1时，纳米粒的包封率由43.39%升高至64.47%，但当继续增加药物浓度至2.5 mg·mL-1时，其包封率下降至35.25%。原因可能是当药物浓度较小时，溶液中药物含量低，不利于药物被包封。随着药物浓度的升高，溶液药物含量也逐渐增大，包封率也随之逐渐升高。但当药物浓度超过一定量之后，有机相的黏度也增大，在水中难以分散，导致包封率下降。因此选择药物浓度范围为1.0-2.0 mg·mL-1。

2.4 2-HP-β-CD浓度筛选 结果表明，随着2-HP-β-CD浓度由1.0%升高至2.5%时，FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的包封率呈逐渐下降的趋势。这可能是因为当FF为一定浓度时，2-HP-β-CD的存在有利于提高FF的溶解度，使其更容易向水相中分散，而难以被疏水性的PLGA包封。因此选择2-HP-β-CD浓度范围为1%～1.5%。

2.5 正交试验设计及结果 正交试验结果(表2)表明，药脂比对包封率影响最为显著，其次为PVA浓度，而药物浓度对包封率影响相对较小，4个因素对包封率的影响程度由大至小可排列为：B>A>D>C。

表2 正交试验结果及直观分析表Tab 2 Orthogonal test results and visual analysis table

进一步将影响因素最小的C组作为误差组进行方差分析(表3)，发现B因素不同水平间存在显著性差异(P<0.05)，为主要影响因素；A、D因素不存在显著性影响，为次要影响因素。综合直观分析与方差分析结果，本试验确定最优处方为A2B3C2D3，即处方中PVA浓度2%，药物与PLGA用量比1∶15，药物浓度2.0 mg·mL-1，2-HP-β-CD

表3 正交试验设计方差分析Tab 3 Analysis of variance of orthogonal test design

浓度为1.5%。按上述最优处方制备3批样品FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs，并以包封率为评价指标，按照“1.7”项下的包封率测定方法，测得平均包封率为(82.02 ± 0.82)%，说明处方的重现性较好且工艺稳定可行。

2.6 FF含量测定结果 以峰面积(A)对浓度(C, μg·mL-1)进行线性回归，得线性拟合回归方程：A=41.211 C+1.553，其中r=0.9999。根据数据说明FF在10 μg·mL-1～100 μg·mL-1浓度内与峰面积线性关系良好。方法学考察表明：在本色谱条件下，高中低三种浓度溶液的平均回收率为99.96%，RSD为0.52% (n=9)，日内精密度RSD=0.73%(n=6)，日间精密度的RSD=0.27% (n=3)，均符合测定要求。

2.7 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的粒径与Zeta电位观察与测定 根据DelsaTM Nano C激光粒度分析仪的测定，FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的粒径为(185.90 ± 2.80) nm(图1A)，PDI值为0.10 ± 0.05，Zeta电位为(-5.92 ± 1.80) mV(图1B)，其电位为负值，可能与粒子表面的环糊精上的羟丙基有关。其外貌形态如图1A所示，表现为半透明乳光状溶液。

图1 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs 外貌，粒径及电位(A为粒径，B为电位)Fig 1 FF-2-HP-β-CD-PLGANPs appearance, particle size and potential (A is particle size, B is potential)

2.8 体外释放行为的研究 体外释放研究在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH值7.4)中通过透析法进行，结果如图2所示，FF的累积释放率远高于FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs组，约4 h即可完全释放，而FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs组4小时内仅释放(37.85±1.36)%，FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的释放速率明显较FF慢且平稳(P<0.05)。后期可持续平稳释放至72 h，其累积释放率为(82.08±1.71)%。说明2-HP-β-CD的加入可作为纳米粒的保护层，阻碍了FF从内核向外扩散，有助于药物的缓慢释放。

图2 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs体外释放曲线Fig 2 FF-2-HP-β-CD-PLGANPs In Vitro Release Profile

体外释放拟合方程结果如表4所示，根据其相关系数判断，FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs拟合效果最符合Ritger-peppas方程，拟合方程为lnQ=0.417lnt+2.794，R2=0.9655，其中n=0.32(<0.5)，属于Fick扩散控制药物释放。

表4 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPS的体外释放拟合方程及相关系数Table 4 Fitting equation and correlation coefficient of in vitro release of FF-2-HP-β-CD-PLGANPS

3 讨论与结论

3.1 包封率测定方法的选定 本文采用改进的乳化-溶剂挥发法，以PLGA作为载体材料，PVA为乳化剂，脂溶性氟苯尼考为模型药物，利用2-HP-β-CD对其进行修饰，以包封率作为评价纳米粒制备工艺的主要指标，选用合适的方法对其进行准确测定。包封率常用的方法有透析法，低温高速离心法、超滤法、微柱离心法、葡聚糖凝胶柱色谱法[14]等。采用葡聚糖凝胶柱色谱法，此法利用具有网状结构的葡聚糖凝胶的分子筛作用，可将纳米粒胶体溶液中的大分子量纳米粒与小分子量游离药物完全分离。

3.2 PLGA种类对包封率的影响 试验前期，本文首先考察了PLGA种类对FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs包封率的影响，分别选用LA/GA为50/50与75/25，分子量分别为10000与20000的PLGA制备纳米粒，结果当LA/GA比值相同时，分子量越大，包封率越高[15]。当分子量较高时(分子量：20000)，提高LA的比例，会使体系黏度过高，反而不利于药物的包封，导致包封率降低，因此本文选用LA/GA为50/50，分子量为20000的PLGA进行单因素试验考察和正交试验设计。

3.3 2-HP-β-CD加入方法对包封率的影响 在前面试验的基础上，考察了2-HP-β-CD的加入方法对包封率的影响。方法1：先制备FF/2-HP-β-CD包合物，再与乳化剂混合作为水相[16]；方法2：将2-HP-β-CD直接加入含有乳化剂的水相中混匀。结果发现方法2制备的纳米粒包封率较高，可能的原因是2-HP-β-CD与乳化剂的共同作用，提高了体系的稳定性和包封率[17]。方法1中FF进入环糊精内腔形成包合物后，增强了FF在水中的分散性，难以进入疏水性载体材料中，造成其包封率偏低。随着2-HP-β-CD浓度的升高，FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的包封率呈逐渐下降的趋势。这可能是因为当体系中FF为一定量时，2-HP-β-CD的存在起到了助溶作用，用量越高，助溶效果越好，使其更容易向水相中分散[8]。

3.4 体外释放结果 体外释放结果表明FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs较FF原药有明显的缓释作用，且可持高浓度平稳释放。可能是由于纳米粒外层有2-HP-β-CD的保护，所以FF没有那么快从孔道中释放出来，这与文献中描述结果相符[18]。所以当载体材料表面包覆一层亲水性物质如2-HP-β-CD，可以避免纳米粒子的吸附或降解，延长了药物的循环时间，提高药物的溶解度与稳定性，控制药物的释放，达到更好的治疗效果。

3.5 结论 本试验选用亲水性材料环糊精修饰氟苯尼考PLGA纳米粒，通过单因素试验，正交试验优化筛选出最优处方为：PVA浓度2%，药物与PLGA用量比1∶15，药物浓度2.0 mg·mL-1，2-HP-β-CD浓度为1.5%。该处方制备的纳米粒的平均包封率为(82.02±0.82)%，体外释药具有缓释行为。