中兽药参黄颗粒的制备工艺优化研究

柯群华，吕亚楠，彭 晶，吴雪琴，严作廷，王胜义*

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/农业农村部兽用药物创制重点实验室，兰州 730050)

母猪围产期常会表现出一系列的症候群，主要包括母猪产前产后便秘、不食，母猪产程长，母猪产后瘫痪、缺乳、奶水质量差，产后不发情等[1-2]。依据中兽医辨证理论，“气血亏虚”是母猪分娩前后的主要问题，也是影响产仔数和仔猪成活率的核心因素。因此，母猪分娩前后的保健主要围绕“气血”进行。参黄颗粒是针对母猪气血两虚研制的中兽药。固体制剂具有稳定性好、体积小，携带方便，易于兽用临床应用等优点，同时加入矫味剂，可以明显改善药物口感。颗粒剂临床使用、运输便捷，性状稳定，都极大的优于合剂[3-4]。中药颗粒剂的制备一般要经过中药材提取、分离纯化和浓缩、辅料的选择及制粒成型等过程，处理方式往往会因方剂的不同而有所差异，故中药颗粒剂制备工艺的优化要从药材的性质、提取溶剂的种类、成型工艺的特点等多个方面进行考虑。试验依据药材的性质采用水煎煮并冷凝回流工艺进行提取、真空冷冻浓缩干燥，并采用正交设计法对参黄颗粒剂敷料配比工艺进行优化，优选出成型工艺，为处方临床大规模生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 中药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；标准检验筛(浙江上虞市金鼎标准筛具厂)，DHG—9240A电热恒温鼓风干燥箱(上海鸿都电子科技有限公司)；Waters2695高效液相色谱仪(Waters公司); AL104电子天平(梅特勒有限公司)；KQ5200DE型台式数控超声波清洗器(东莞市科桥超声波设备有限公司)；电热套(上海瑞兹仪器设备有限公司)；SCIENT2—10 N冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.1.2 药品与试剂 党参、熟地黄和陈皮等中药饮片均购自黄河中药材市场，无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)，橙皮苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110721-201617，含量以96.1%计)，可溶性淀粉(国药集团化学试剂有限公司，批号：20190618)，蔗糖(国药集团化学试剂有限公司，批号：20190617)，糊精(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：F1904115)。

甲醇、乙腈为色谱纯，冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司，批号：20181030)为优级纯。

1.2 方法

1.2.1 提取工艺设计

1.2.1.1 正交实验： 采用L9(34)因素水平正交实验对参黄颗粒提取工艺进行优选。以料液比(A)、提取次数(B)和提取时间(C)作为考察因素，每因素分设3个水平[5]。以橙皮苷含量、浸膏率作为考察指标，因素水平安排见表1。

表1 工艺因素水平设计表Tab 1 Design table of process factor level

按照处方比例分别称取党参、熟地、麦冬、茯苓、白术、木香、陈皮和甘草，共9份(每份100 g)。按照表1所示，依次以水为溶媒加热冷凝回流提取、过滤合并滤液，80 ℃浓缩，定容至100 ml，测定各样品中橙皮苷含量；精确量取各提取液60 ml，转入干燥至恒重的蒸发皿中水浴蒸干处理，转移至干燥箱中，100 ℃干燥4 h，于干燥箱中冷却至室温后迅速称重；最后计算得出膏率(总干膏/药材总质量×100%)，重复三次。

1.2.2 干浸膏粉的制备 在确定最佳提取工艺后，根据散剂处方准确称取中药饮片，适当粉碎后，放入大容量圆底烧瓶中，冷凝回流提取，药材质量9倍的水，回流提取3次，每次提取时间1 h，提取完成后，双层纱布过滤药渣，合并提取液。将所有滤液常压浓缩到粘稠状，之后分装于冷冻干燥托盘中，放置于-80 ℃冰箱冷冻6 h，后放入冷冻减压(≤-40 ℃，0.1 pa)干燥机中干燥，干燥后的浸膏剂进行粉碎，备用[6]。

1.2.3 辅料的筛选 辅料和药物的配比以及辅料的种类是影响颗粒质量的关键因素，根据 2020 年《中国兽药典》第二部(附录8)中的要求，辅料量一般不超过药物量的2倍，因此，试验选择药物和辅料的配比为3∶4。辅料种类是影响制粒成型的重要因素，根据预实验选择可溶性淀粉、糊精和蔗糖作为制粒辅料，干浸膏粉与辅料的配比见表2。

表2 不同处方颗粒剂配方表(份)Tab 2 Formula table of Different prescription Granules (copies)

1.2.4 湿法制粒 按处方准确称取药物(干浸膏粉)和辅料，混合均匀，使用乙醇作为润湿剂，通过喷淋的方法加入，边加边搅拌，直至能形成软材，使其“手握成团，轻压即散”，使用 10 目筛手动制粒，在60 ℃下干燥，用 10 目筛整粒，用于指标的测定。

采用成型率、堆密度、休止角、溶化性以及吸湿指标来综合评价颗粒的质量，综合指标 =(20/最大成型性值)×成型性值 + (15/最大堆密度值)×堆密度值 +(最小休止角值 ×15)/45止角值 +(20/最大溶化性值)×溶化性值 +(最小吸湿率值 ×30)/吸湿率值，通过采用加权评分法分析试验结果，优化辅料的筛选和颗粒的成型工艺。

1.2.5 正交试验优化 根据2020版《中国兽药典》及现有文献资料关于制粒的要求，选择药物与辅料配比(A)，乙醇浓度(B)，烘干温度(C)，通过正交设计助手ⅡV3软件设计进行L9(34)的正交实验优化颗粒剂的制备[7]，优化实验表见表3。按1.2.4制粒，测定颗粒的成型率、堆密度、休止角、溶化性、吸湿性指标[8-10]。

表3 正交试验设计因素水平表Tab 3 Factor level table of orthogonal experiment design

1.2.5.1 成型率测定 将制备好的颗粒称重，先过一号筛，再过四号筛，收集能通过一号筛但不能通过四号筛的颗粒，称重。成型率=过筛后颗粒质量/过筛前颗粒质量×100%。成型性分值计算运用公式：(20/最大成型性值)×成型性值。

1.2.5.2 堆密度的测定 将过筛后的颗粒放入干燥的量筒中，轻轻振动，读出其近刻度处的mL数(V)；将过筛后的质量作为M(g)，两者的比值即为堆密度。堆密度=M/V堆密度分值计算运用公式：(15/最大堆密度值)×堆密度值。

1.2.5.3 休止角测定 采用固定漏斗法，将3只漏斗串联并固定于铁架台上水平放置的同心圆坐标纸上1 cm的高度处，小心地将颗粒沿漏斗壁倒入最上的漏斗中，直到坐标纸上形成的颗粒圆锥体尖端接触到漏斗口为止，由坐标纸测出圆锥底部的直径(2R)，计算出休止角tan=H/R，做5次，计算平均值。休止角分值计算运用公式：(最小休止角值×15)/休止角值。

1.2.5.4 溶化性测定 在干燥恒重的50 mL离心管中加入精密称定的颗粒，精密加入沸水至50 mL刻度线，搅拌振摇5 min，3000 r/分钟离心15 min，弃去上清液，在70 ℃将残渣烘干至恒重，精密称定，计算溶化率。溶化率=溶化颗粒质量/颗粒质量×100%。溶化率分值计算运用公式：(20/最大溶化性值)×溶化性值。

1.2.5.5 吸湿性测定 取一定量的颗粒剂，置30 ℃烘箱中恒重48 h。将底部放有NaCl饱和溶液的玻璃干燥器中定时放入NaCl直到形成NaCl过饱和溶液，此时干燥器内的相对湿度为 75%。在已知恒重的小烧杯中放入约10 g参黄颗粒，准确称重后置于上述干燥器内。48 h后称量，计算吸湿百分率。共做两组，计算平均值。吸湿百分率%=(吸湿后重量-吸湿前重量)/吸湿前重量×100%。吸湿率分值计算运用公式：(最小吸湿率值 ×30)/吸湿率值。

1.2.6 验证性实验 根据制备颗粒剂正交试验的结果，重复制备三批颗粒制剂。按处方配比准确称取原料，按正交试验优选工艺进行制粒，测定各项评价指标，计算综合评分。

1.2.7 统计与分析 采用正交设计助手ⅡV3软件对计算处理后的数据进行正交统计分析。

2 结果与分析

2.1 橙皮苷系统适应性试验结果 试验结果见图1-图3。结果，样品中橙皮苷与相邻杂峰分离良好，阴性样品在橙皮苷处无吸收，不干扰参黄颗粒中橙皮苷的含量测定，表明在利用HPLC-UV方法测定参黄颗粒中橙皮苷含量中，该方法的系统适应性好。理论塔板数按橙皮苷计为8132。

图1 橙皮苷对照品色谱图Fig 1 Chromatogram of Hesperidin standard

图2 参黄颗粒剂供试品中中橙皮苷色谱图Fig 2 Chromatogram of Hesperidin in Shenhuang granules

图3 阴性样品中橙皮苷色谱图Fig 3 Chromatogram of Hesperidin in negative sample

2.2 中药提取工艺正交实验结果 中药提取工艺正交交试验结果及极差分析见表4.1、4.2，影响参黄颗粒回流提取效果的因素大小依次为A>C>B，最佳组合为A2B2C3，即最佳水提工艺为加9倍水，回流提取3次，每次提取时间1 h。总评分=A1+A2；A1=(橙皮苷/最大橙皮苷含量)×50、A2=(出膏率/最大出膏率)×50；提取工艺验证：为考察参黄颗粒优选工艺的可靠性和稳定性，需按照最佳优选方案对3批次参黄颗粒水提液进行验证，结果表明橙皮苷含量分别为1.005、0.995、1.007 mg/g，出膏率分别为26.08%、25.31%、26.46%，符合预期设计。

表4-1 正交实验结果Tab 4-1 Orthogonal experiment results

表4-2 方差分析表Tab 4-2 AnOVA table

2.3 成型率测定 成型率测定结果见表5。

表5 成型性测定结果Tab 5 Test results of formability

2.4 堆密度测定 堆密度测定结果见表6。

表6 堆密度测定结果Tab 6 Measurement results of heap density

2.5 休止角测定 休止角测定结果见表7。

表7 休止角测定结果Tab 7 Measurement results of Angle of repose

2.6 溶化性测定 溶化性测定结果见表8。

表8 溶化性测定结果Tab 8 Solubility test results

2.7 吸湿性测定 吸湿性测定结果见表9。

表9 吸湿性测定结果Tab 9 Results of hygroscopicity measurement

2.8 综合评价 通过对制备颗粒的成型性、堆密度、休止角、溶化性、吸湿性按一定百分比综合评价来得出颗粒剂的最终评价得分，综合评价结果见表10。

表10 综合评价结果Tab 10 Comprehensive evaluation results

2.9 正交试验结果及分析 通过正交实验结果分析可知，确定各因素与水平的最佳组合应为A2B1C2，即最佳制粒工艺为：选用浸膏粉∶可溶性淀粉∶糊精∶蔗糖比例为3∶2∶2∶1，用80%乙醇制成软材，过16目筛制粒，于60 ℃烘干。结果见表11。

表11 正交实验结果Tab 11 Orthogonal experiment results

2.10 成型工艺验证 取1.2.1项下制得的干浸膏粉，按照选出的成型工艺平行操作制备三批颗粒剂，按照上述制备3批颗粒剂，按上述方法综合评分，计算综合评分97.18，96.99，97.21，RSD值为0.13%，验证结果与正交试验结果基本一致，说明提取工艺稳定，可行，重复性好。将上述按最佳方案所制得的颗粒分别取 10 g，加热水 200 mL，搅拌 5 min，其颗粒基本全部溶化，均符合2020 版《中国兽药典》二部(附录8)颗粒剂项下的有关规定。

3 讨论与结论

长期以来，由于汤剂易吸收、起效快、疗效好、制备方法简单等特点，一直是中兽医临床的主要用药形式，历代中兽医在使用中兽药时，也大多采用汤剂，然而在实际生产应用过程中汤剂却存在很多缺点，比如口味不佳、不易携带、不易储存、保质期短等，因此本实验本着中兽药制剂向着疗效好、质量稳定可控，便于贮存、携带、运输，使用方便的发展原则，且适用于工业生产，故将颗粒剂作为首选剂型[11-12]。

中兽药复方的作用与多种成分相关，用一种评价指标筛选参黄颗粒的提取工艺和制备工艺的条件往往不够全面。出膏率是中成药制药行业提取中一个特有名词以及重要的质量管理指标。同时，浸膏是中兽药药效的物质基础，是中兽药制剂制备的中间品，是提取工艺最直观的产物，对评价一种提取工艺的优劣有着重要意义。有效成分是中兽药复方发挥药效作用的物质基础，但是复方中的有效成分多且复杂，若是选取所有的有效成分作为指标考核制备工艺显然无法实现，因此实验中多采用选取复方中主药的有效成分作为指标来评价制备工艺的优劣[13-14]。在预试验阶段，选择对党参中党参炔苷进行含量测定，结果显示党参炔苷含量较低，不宜作为参黄颗粒工艺优化的定量测定；同时，在预试验阶段也选择了熟地黄中毛蕊花糖苷进行含量测定，结果显示毛蕊花糖苷含量也较低，且分离度较差，故也不宜作为参黄颗粒工艺优化的定量测定；而采用以陈皮中橙皮苷为含量测定指标时，结果表明橙皮苷的峰型较高，分离度和对称性好，阴性无干扰。最终，确定本试验通过多因素正交试验的方法，以橙皮苷含量和浸膏得率为指标，考察提取工艺；以颗粒剂成型性、堆密度、休止角、溶化性以及吸湿性进行综合评价，考察制备工艺。通过综合评价处理数据，以及直观分析和方差分析，优化实验条件，得到的结果更为科学合理。

在对药材水提后的浸膏进行干燥时，因为采用普通烘干箱烘干所需时间会较长，同时制得的干膏干燥程度不够，质地粘软，不宜粉碎，此外，整个干燥过程在低温和非常稀薄的空气中进行，可避免常见的干燥加工过程中物料热敏性成分的破坏和易氧化成分等劣变反应，处理后的产品活性物质(特别是药用有效成分)保存率高，芳香物质挥发性降低，产品性味浓厚，所以在浓缩到稠浸膏后选用冷冻真空干燥进行干燥处理。同时考虑到药材水提物粘度大，干膏打粉后极易吸潮结块，在制粒过程中产生死颗粒，所以将传统制粒步骤加以改进，在真空冷冻干燥步骤前向浸膏中加入一定量的可溶性淀粉搅拌均匀，来防止发生这种问题，结果表明效果良好。

中药提取物工艺采用正交试验法，以橙皮苷及浸膏得率为评价指标，筛选出最佳提取工艺为：称取党参，熟地，麦冬，木香，茯苓，白术，陈皮，甘草，加 9倍量回流3次，每次1 h，合并三次提取液，过滤既得。验证试验结果基本一致，该提取方法稳定、可行。

以颗粒剂成型性、堆密度、休止角、溶化性以及吸湿性为综合评价，设计正交试验，筛选出最佳制粒工艺为：选用可溶性淀粉、糊精、蔗糖为辅料，浸膏粉：可溶性淀粉：糊精：蔗糖比例为3∶2∶1∶1，用80%乙醇制成软材，过 16 目筛制粒，于 60 ℃烘干。验证结果与正交试验结果基本一致，说明提取工艺稳定，可行，重复性好。

根据以上实验结果，确定了参黄颗粒剂的制备工艺：加 9 倍量的水回流提取3次，每次 1 h，合并3次提取液，过滤。取滤液浓缩至相对密度为 2 g/mL的清膏，铺平冷冻干燥圆盘(3 mm厚度，多次少量)，减压冷冻干燥(-50 ℃以下，0.0001Mpa)至恒重，粉碎成细粉得干膏粉。以浸膏粉：可溶性淀粉：糊精：蔗糖= 3∶2∶1∶1 的比例，混合均匀，加 80%乙醇制成软材，过10目筛制粒，60 ℃烘干，整粒后，既得。